昆虫是地球上最繁盛的动物类群，种类多，分布广，形态多样。其丰富多样的体色模式，长期受到世界各国研究者的高度关注，一直是生物学领域的研究热点。黑化是昆虫普遍而主要的着色模式，不仅能产生丰富的表型多形性，还在适应性进化等方面起着重要作用。昆虫的黑化现象主要是由黑色素积累引起的。目前，昆虫黑色素生物合成过程的基因、蛋白质和相关的代谢物质，在众多昆虫中已经被比较系统地研究。然而，越来越多的研究表明，昆虫黑化除了与黑色素合成代谢途径的基因密切相关之外，也可能受其他基因或遗传位点的调控，这表明昆虫黑化的分子机制复杂多样，还有待进一步研究。　　家蚕是重要的农业经济昆虫，也是鳞翅目昆虫的模式生物，在害虫防治与生物科学研究上有着重要地位。超过百年的家蚕遗传学研究为我们累积了大量的体色突变遗传资源。以往对家蚕体色突变体的大量研究，增强了我们对家蚕色素沉着过程和昆虫黑化现象的遗传机制的基本认识，还为进一步阐明昆虫体色调控机制提供了理论参考和技术支撑。　　从性黑蛾（sex-controlled melanism,sml）是本研究团队新发现的家蚕成虫期特异黑化突变体。它是一种常染色体隐性自发突变，且只有sml雄蛾表现出明显的黑化表型。之前的遗传分析表明，该黑化突变体不同于以往报道的黑化变异，暗示未知的新基因（新机制）导致了此黑化表型。本研究选择黑化突变sml作为研究对象，利用定位克隆等多种技术确定变异位点，并对候选基因的相关功能及黑化调控机制进行研究。获得的主要研究结果如下：　　1.家蚕从性黑蛾（sml）的表型观察与分析　　为了探明家蚕从性黑蛾（sml）的具体表型特征，我们对其表型进行了连续的观察分析。其基本体色特征为：幼虫和蛹体色为普通型，雄蛾灰黑色（突变型），雌蛾为野生型体色（白色或略带灰色）。在标准饲养条件下，蛹8天之前，sml雄性个体与其雌性及野生型品系的体色没有明显差异；发育到蛹8天后，sml雄性个体颜色逐渐加深，变黑；进入蛹9天时，sml雄性个体全身黑色；蛹9天的后半天（蛹期持续约9天）陆续羽化为黑蛾。通过组织部位的比较观察结果显示：sml雄蛾主要表现为鳞片黑化，其背板、触角以及羽化后的蛹壳等组织部位的颜色与其雌性或野生型个体没有明显差异。　　在幼虫期对雌雄差异器官（生殖器官原基：生殖腺和生殖芽等）的摘除实验结果显示：摘除生殖腺（精巢、卵巢）和生殖芽（雄性为赫氏腺，雌性为石渡氏腺），对sml雌雄个体的蛾体色没有产生明显影响。由此推测：生殖腺和生殖芽等生殖腺体对sml成虫体色没有决定性的调控作用。　　对成虫存活时间的统计分析结果显示：在未交配的情况下，野生型对照组家蚕品系（普通蛾体色）雌蛾存活时间均比雄蛾长，且差异显著；sml雌蛾（普通蛾体色）的存活时间与对照组相当，而sml雄蛾（黑化）存活时间显著延长，并且显著长于雌蛾。表明：sml黑化个体（雄性黑蛾）存活时间更长。这一结果暗示：在某些情况下，昆虫的黑化可能会增强个体的生命力，延长存活时间。　　2.家蚕从性黑蛾（sml）的转录组测序分析　　为了全面地调查与sml雄蛾突变表型相关的转录组水平信息，我们选用开始黑化（蛹8天）的sml和野生型Dazao品系（分雌雄）样本，进行转录组测序比较分析。4个样品文库依次为：sml雄（编号为 sml_M），sml雌（编号为 sml_F）。Dazao雄（编号为DZ_M）和Dazao雌（编号为DZ_F）。　　3个黑-白配对比较组（sml_MVS sml_F，sml_MVSDZ_M和sml_MVSDZ_F）分别有168、503和623个差异表达基因（DEGs）。我们通过构建维恩图排除因遗传背景和性别差异导致的差异表达基因后，共筛选到59个主要与黑化表型相关的DEGs。　　基于转录组表达数据和功能注释，我们分析发现：与三个白蛾样本相比，这59个DEGs在黑蛾样本（sml雄）中有49个基因上调表达，10个基因下调表达；其中有24个（约占59个候选DEGs的41％）表皮蛋白基因，包括7个CPR（含R&R共有序列的表皮蛋白）、7个CPG（富含甘氨酸的表皮蛋白）、1个CPT（含Tweedle基序的表皮蛋白）和9个CPH（假定表皮蛋白）基因。22个表皮蛋白基因的表达量在黑蛾样本（sml雄）中显著上调，暗示这些表皮蛋白基因与sml黑化表型相关（如：可能参与黑色素转运或附着）。另外我们发现：昆虫黑色素生物合成过程的2个关键基因laccase2（BGIBMGA006745）和yellow（BGIBMGA001149），在sml黑蛾样本中表达量显著上调，暗示sml黑化基因能通过上调yellow和laccase2的基因表达量，调节家蚕黑色素生物合成通路，进而产生黑蛾表型。同时，我们发现laccase2 B亚型转录本（BGIBMGA006746）也在sml黑蛾样本中显著高表达，说明该亚型可能参与家蚕蛹后期及其后的黑化过程。除此之外，我们还在候选DEGs中发现1个过氧化氢酶基因（BGIBMGA011430）和1个胰岛素类似蛋白基因（家蚕素E-1，BGIBMGA000667）。据报道，这两类蛋白可以影响生物寿命，这可能为研究sml成虫期寿命延长现象的分子机理提供重要线索。　　3.从性黑蛾（sml）位点的分子定位分析　　利用分布于家蚕各连锁群（染色体）的形态标记和简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）分子标记对sml进行连锁分析，结果显示：sml位点与位于第17连锁群（第17染色体）的分子标记连锁，而与其它连锁群的分子或形态标记均为独立遗传关系，由此判断sml突变位点位于家蚕第17染色体。　　我们利用分子标记和小规模定位群体（159个BC1M个体）对sml位点进行了初步定位，并构建了分子标记连锁图谱，将 sml位点初步锁定在17号染色体nscaf2829上的分子标记M3和M11之间。sml位点与M3和M11的遗传距离分别为1.9cM和3.1cM。在初定位区间中补充新的分子标记后，我们利用大规模的定位群体（1573个BC1M个体）进行了精细定位，最终将sml位点锁定在标记M5和M9之间，区间长度约403kb，且在区间内发现3个与sml位点紧密连锁（不交换）的标记（M6、M7和M8）。　　蛾体色是家蚕的一个驯化性状。因此，我们通过ROD（reduction of diversity）法，对多个品系的家蚕（白蛾）和野蚕（蛾体色黑，斑纹偏多）的基因组重测序数据的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms单核苷酸多态性）进行了分析，筛查了家蚕基因组中的驯化选择靶点，并通过Tajima’D检验等方法验证靶点的可靠性。结果表明：sml定位区间受驯化选择强度较大，是家蚕驯化选择的候选靶点，说明该区域与蛾体色调控和驯化紧密相关。　　4.候选基因筛查、克隆及功能研究　　定位区间内共有23个预测基因。为了筛选候选基因，我们采用荧光定量PCR技术调查区间内基因的表达，发现区间内有4个基因（BGIBMGA005552、BGIBMGA005557、BGIBMGA005652和BGIBMGA005662）在sml突变体中的表达量显著低于野生型Dazao。　　基因功能注释结果显示：BGIBMGA005652是保守的细胞周期调控因子 fizzy基因家族成员，它在袖蝶中的同源基因（poik）能调控拟态的色彩模式；BGIBMGA005557编码一个ATP结合蛋白，具有转移酶活性和核苷酸磷酸酶活性，在果蝇中的直系同源基因能调控翅的形态发生；BGIBMGA005552编码一个平滑肌钙调素结合蛋白，其在果蝇中的直系同源基因参与神经细胞的发育过程；BGIBMGA005662编码一个WD40重复结构域蛋白，在果蝇中的直系同源基因有去甲基化酶活性。　　我们克隆了sml突变中这几个基因的cDNA及基因组序列，并且分析比较了它们与野生型序列的差异。结果显示：与野生型Dazao相比。sml中基因BGIBMGA005557的转录区和基因上下游均有大量的短片段的插入缺失和碱基替换突变，致使ORF框被破坏，无法正常翻译为功能蛋白；基因BGIBMGA005652上游约5kb的位置有一段长约20kb的大片段缺失；基因BGIBMGA005552的转录起始位点上游有短片段的插入突变和大量碱基替换变异；基因BGIBMGA005662内含子和转录区下游有短片段的插入突变和大量碱基替换变异。　　为了验证这几个候选基因的缺陷是否能导致黑化表型，我们通过 RNAi技术,下调了它们在野生型个体中的mRNA表达量,结果显示，下调BGIBMGA005552、BGIBMGA005557和BGIBMGA005652基因表达量后，野生型蚕蛾产生不同程度的黑化表型；在基因BGIBMGA005662 RNAi干涉组中未见黑化表型个体。我们推测，基因BGIBMGA005552、BGIBMGA005557和BGIBMGA005652均参与家蚕成虫体色调控，sml的黑化表型可能是由多基因的功能缺陷或异常表达共同导致的。　　由于sml雄蛾表现为黑化表型，而前期的转录组实验结果也显示突变体中黑色素生物合成过程中的部分基因表达异常，所以我们采用荧光定量PCR技术调查了黑色素生物合成过程中关键基因的表达模式。结果显示：黑色素形成和沉积过程中的关键基因yellow和laccase2在野生型个体蛹复眼着色后有一个表达高峰；它们在sml雄蛾（黑化）中的表达模式与野生型相似，但表达量显著的高于野生型，且yellow基因在蛹7天的相对表达水平极高；其余基因的表达差异不明显。由此我们推测，sml的候选基因能通过控制蛹后期yellow和laccase2的基因表达水平（主要是yellow基因），调节黑色素的生物合成，进而调控家蚕蛾体色。　　5.鳞翅目昆虫中sml同源区域的生物信息分析　　在不同鳞翅目昆虫物种中，对sml位点所在的基因组区域进行了同源比对和生物信息分析。研究发现，sml的候选基因组区域与其它鳞翅目昆虫的体色调控区域（HmYb、P、Cr和 carbonaria）同源，表明此区域是鳞翅目昆虫中控制成虫体色模式的保守调控位点。同时我们还发现。sml位点中有2个候选基因BGIBMGA005557和BGIBMGA005652位于桦尺蠖工业黑化核心调控区域的同源区域中。桦尺蠖工业黑化现象是自然选择的一个经典案例，但先前的研究只鉴定了控制工业黑化的染色体区域carbonaria。值得注意的是，本研究的sml黑蛾和工业黑化蛾有着十分相似的表型，并且它们还被同源的遗传位点调控。综合上述信息，我们有理由推测：家蚕蛾体色调控基因BGIBMGA005557和BGIBMGA005652在桦尺蠖（Biston betularia）中的直系同源基因，可能就是导致工业黑化现象的功能基因。因此，本研究结果不仅为进一步阐明鳞翅目体色调控的分子机制提供了重要的实验数据支撑，还为解析工业黑化现象的分子机制提供了重要依据。