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肝细胞肝癌是一种很常见的恶性肿瘤,预后较差。肝细胞肝癌在亚洲和非洲的某些区域高发,在中国,越来越成为影响健康的一大威胁。虽然目前采用了手术切除、肝移植、插管介入化疗(TAE)和局部射频消融(RFA)等治疗手段,但肝细胞肝癌的长期生存率还是没有大的提高,所以利用新手段新方法进行肝癌治疗研究非常必要。2006年Li等报道靶向基因启动子区的dsRNA(double-stranded RNA)能引起序列特异性的基因转录激活。并把此现象命名为RNA引起的基因激活((?)RNA activation,RNAa),而把这样的dsRNA称为小激活RNAs (small activating RNAS,saRNAs)。该项技术通过改变染色体的结构导致内源性靶基因表达增强。它能激活许多失活的抑癌基因或增加活性较低的基因的表达量,从而起到治疗肿瘤的作用。WT1(Wilms’tumor1gene)是与器官发育和细胞生长相关的重要核因子。它是人体内一个复杂的基因,具有双向调节功能。它的抑制或者激活功能与细胞类型以及其本身的表达水平密切相关。据报道,将质粒介导的WT1-KTS亚型转染肝癌细胞株,将导致其p53非依赖性凋亡。最近的研究显示,WT1在42%的人肝癌组织中表达,而在58%的人肝癌组织中不表达。然而,它在肝癌发生发展中的作用机制至今尚未阐明。本研究旨在揭示靶向WT1基因启动子的dsRNA在肝癌细胞株HepG2中的作用。我们发现靶向WT1基因启动子的dsRNA可以上调WT1基因的表达,进而导致与Bcl-2家族调控相关的凋亡。本文的主要研究内容及结果如下：第一部分功能性小激活RNAs的筛选目的基于小激活RNAs (saRNAs)的肿瘤治疗策略,为WT1基因筛选出具有激活功能并相对高效的候选saRNAs分子。方法利用文献提供的saRNA设计规则,为每个靶基因设计3对候选saRNAs分子,对照组dsRNA设计成与人基因组序列非同源。将上述合成的候选saRNAs分子转染肝癌细胞株HepG2,每一种细胞系均包括空白组,对照组(转染对照组dsRNA)和saRNA组(转染候选saRNA).采用Real-time quantitative PCR (qPCR)检测转染后人肝癌细胞靶基因WT1的mRNA表达水平。根据靶基因表达水平筛选出功能性saRNAs,然后将“功能性saRNAs"定义为使靶基因mRNA表达量增加至少两倍(RT-PCR法)。采用Western blot验证转染后人肝癌细胞靶基因WT1的蛋白表达水平结果dsWT1-755和dsWT1-688均未能上调细胞中靶基因mRNA的表达水平；与对照组相比,dsWT1-326实验组细胞内的WT1mRNA和蛋白水平明显增加,为对照组的2倍左右。结论筛选出了功能性saRNA,即dsWT1-326,具有特异性激活肝癌细胞株HepG2中WT1基因的功能。第二部分dsWT1-326诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其机制研究目的研究dsWT1-326在体外对人肝癌细胞株HepG2细胞活性、集落形成和细胞凋亡的影响,并进一步探讨其诱导凋亡的分子机制。方法应用相差显微镜观察经dsWT1-326作用的HepG2细胞形态学改变。采用MTT法检测不同浓度的dsWT1-326及作用不同时间(48h和72h)后对HepG2细胞增殖的影响。采用平板克隆形成试验观察dsWT1-326对HepG2细胞克隆形成的影响。采用流式细胞仪(PI和Annexin V双染法)检测细胞凋亡率的变化。利用Western blot检测Bcl-2、Bak、Caspase-3和PARP等蛋白在诱导细胞凋亡中的作用。结果1.相差显微镜观察发现转染dsWT1-326的HepG2细胞在48h和72h后,与对照组相比,细胞数量明显少；贴壁细胞大部分生长停止,并出现细胞变形、皱缩甚至细胞死亡,培养基中可见大量漂浮的死亡细胞。2.MTT实验显示dsWT1-326能显著抑制HepG2细胞增殖,并随药物浓度升高(2～50nM)和作用时间的延长(48～72h)其抑制作用增强,呈明显浓度和时间依赖性。克隆形成试验显示,dsWT1-326处理HepG2细胞后,明显降低克隆形成的数量和大小3.通过流式细胞仪检测发现,dsWT1-326诱导HepG2细胞凋亡呈明显的时间依赖性。而在转染48h或72h后,早期调亡的细胞比例分别增加到(5.5±0.7%vs1.2±0.3%)和(2.1±0.4%vs0.9±0.3%),而晚期凋亡的细胞比例分别是(8.3±1.1%vs2.2±0.4%)和(17.9±2.3%vs2.1±0.3%),与对照组相比明显增多。除此之外,dsWT1-326转染HepG2细胞72小时后坏死细胞比例也达到(15.4±1.7%)。4. Western blot显示Bcl-2与对照组细胞相比,在dsWT1-326转染72小时后的细胞中表达明显下降,相应的Bak蛋白明显升高,与该实验组显著增加的细胞凋亡现象一致。dsWT1-326转染72小时后的细胞中Caspase-3的表达量明显下降,剪切Caspase-3增加,预示着Caspase级联反应的发生。而PARP是Caspase-3的底物,其89kDa的剪切片段在dsWT1-326作用的细胞中也相应明显增加。这些凋亡相关蛋白的明显变化进一步肯定了dsWT1-326的凋亡诱导作用。结论：dsWT1-326能有效诱导人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡,通过上调Bak、下调Bcl-2、进而激活caspase-3和PARP最终诱导凋亡的发生。揭示dsWT1-326上调WT1基因表达在肝细胞肝癌中可能具有一定的治疗前景。