论文部分内容阅读
目的:1.建立一种同时测定血浆中色氨酸(tryptophan,Trp)与犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)的高效液相色谱程序波长设计紫外检测方法(HPLC-VWD))。2.用HPLC-VWD内标法测定正常人和慢性乙肝患者血浆中Trp与Kyn浓度,探讨乙肝患者Trp代谢的变化。3.建立一种高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FD)同时测定血浆中谷胱甘肽(glutathione,GSH)、半胱氨酸(cysteine,Cys)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、半胱氨酰甘氨酸(cysteinylglycine,CysGly)四种硫醇物浓度并对它们各自的总量、还原型和游离型分别定量。4.利用主成份分析(principal components analysis,PCA)研究尿毒症患者透析前后血浆硫醇物的代谢。5.利用偏最小二乘法判别分析(partial least-squares discriminant analysis, PLS-DA)及其载荷图研究血浆硫醇物对尿毒症的诊断能力。方法:1.以3-硝基酪氨酸(3-nitro-tyrosine,3-N-Tyr)为内标,采用Agilent Hypersil ODS (125.0 mm×4.0 mm,5μm)分离。流动相为醋酸缓冲液(15 mmol/L, pH 5.5):乙腈为94:6(v/v);流速为0.8 mL/ min;柱温:25℃;紫外程序化检测波长:0～4.0 min, 360 nm; 4.1～5.0 min, 302 nm。用此方法测定15例正常人和15例慢性乙肝患者血浆中Trp与Kyn。2.以tris-(2-carboxylethyl)-phosphine (TCEP)为还原剂,N-(1-pyrenyl) maleimide (NPM)为衍生剂,采用Agilent Hypersil ODS (250.0 mm×4.0 mm,5μm)分离。流动相A:15 mmol/L醋酸盐溶液,流动相B为乙腈,流动相C为水溶液(300 ml水中加入1 ml醋酸和1 ml磷酸),梯度洗脱。柱温:25℃,流速:0.5 ml/min,检测波长:激发波长330 nm,荧光波长380 nm,进样量:20μl。用所建立的方法检测28例健康人和29例尿毒症患者血液透析前后血浆中总量、游离型和还原型GSH、Cys、Hcy、CysGly浓度。结果:1. Kyn与Trp的保留时间分别为2.9 min和4.4 min,线性范围分别为0.442μmol/L ~18.3μmol/ L和3.67μmol/L ~470μmol/L,检测限分别为0.014μmol/L和0.122μmol/L。Kyn与Trp的日内变异均小于3%,日间变异均小于4%。平均回收率均在92.29%与104.4%之间。慢性乙肝组Kyn/Trp明显高于对照组。2. GSH、Cys、Hcy和CysGly总量的线性范围分别为2.00~80.0μmol/L,10.0~1500μmol/L,1.00~120μmol/L,3.00~240μmol/L,r为0.9990～0.9999,具有良好的相关性。GSH、Cys、Hcy和CysGly还原型的线性范围分别0.10~8.00μmol/L,1.25~50.0μmol/L,0.01~4.00μmol/L,0.05~6.00μmol/L,r为0.9992～0.9996,具有良好的相关性。最低检测限为0.005～3.0μmol/L。所测硫醇物浓度,日内精密度不超过5.0%,日间精密度均小于9.0%。平均回收率为80%～115%。3.①尿毒症患者透析前血浆中Hcy、Cys和、CysGly总量、游离和还原型浓度高于正常组,GSH总量、游离和还原型浓度低于正常组。②尿毒症患者透析后血浆中各种形式的GSH均较正常组低。总量与游离型Cys透析后降至正常,但还原型Cys仍高于正常。Hcy总量和还原型透析后降至正常但游离型高于正常。透析后各种形式的CysGly浓度均高于正常组。③尿毒症患者血浆总量、游离和还原型Cys和Hcy浓度透析后比透析前分别降低。总量Cys和Hcy浓度分别降低了56.5%、53.6%;游离型Cys和Hcy浓度分别降低了81.5%、48.1%;还原型Cys和Hcy浓度分别降低了23.8%、51.9%。血浆总量、游离和还原型GSH和CysGly浓度透析前后无明显变化。④主成分得分图显示透析前与透析后和正常组基本区分,透析前相对分散,透析后相对集中且更接近于正常组。⑤运用PLS-DA模型诊断尿毒症透析前患者,正确率为93.1%;诊断透析后患者,正确率为82.8%;其总的判对率为89.3%。结论:1.本研究建立了一种HPLC-VWD检测法同时测定血浆中Kyn和Trp,采用内标法定量。本方法操作简便,分析时间短,内源性物质干扰小,特异性好,准确度高,适合于临床检验。2.本文建立了以NPM为衍生剂,TCEP为还原剂的硫醇物柱前衍生荧光检测法。该方法不仅可同时测定tGSH、tCys、tHcy和tCysGly,还可测定他们各自的游离型和还原型。该方法简单、快速、灵敏。3.本研究发现尿毒症患者硫醇物的代谢发生了紊乱。透析对尿毒症患者硫醇物的代谢紊乱的纠正有明显效果。建立PLS-DA模型能很好的判别透析前患者、透析后患者和正常对照组。载荷图表明rHcy、fHcy和tHcy与透析前的尿毒症患者密切相关且rHcy对尿毒症的诊断更有价值。