【摘 要】
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溶菌酶(lysozyme,LYZ)是一种细菌细胞壁水解酶,对革兰氏阳性细菌具有直接溶解作用,对革兰氏阴性细菌和某些真菌具有间接溶解作用,在医学临床和食品工业等领域具有广泛的应用
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溶菌酶(lysozyme,LYZ)是一种细菌细胞壁水解酶,对革兰氏阳性细菌具有直接溶解作用,对革兰氏阴性细菌和某些真菌具有间接溶解作用,在医学临床和食品工业等领域具有广泛的应用。目前使用的溶菌酶主要是鸡蛋清溶菌酶,用于人体时具有一定的免疫原性和副作用。天然人溶菌酶(hLYZ)能从人乳、胎盘或唾液中少量提取,但来源极为有限,无法满足医学临床的需要。大肠杆菌等原核细菌表达系统虽然具有表达水平高和成本低等优点,但表达的hLYZ为无活性的包涵体。转基因动物生物反应器虽然具有表达水平高和表达产物活性完全等优点,但相关技术复杂,目前尚未达到产业化开发水平。转基因鸡输卵管生物反应器的技术难度更大,目前还无高水平表达重组蛋白的报道。鸡输卵管暂态表达系统具有技术难度低等优点,但现有的方法表达水平低,难以满足产业化开发需要。 为了获得敏感性和重复性好的定量测定溶菌酶的方法,本研究对文献报道的RBB-R染料标记比色法和琼脂平板扩散法进行了比较研究,结果表明用RBB-R染料标记比色法检测蛋清中的LYZ具有灵敏度高、准确性和重复性好等优点。 为了获得具有产业化开发价值的rhLYZ,本研究将序列正确的hLYZ cDNA克隆入自行构建的输卵管特异表达载体pOV1和pOV2,获得的重组表达载体分别命名为pOV1LYZ和pOV2LYZ。将重组载体与聚乙烯亚胺(PEI)包被后,分别注射产蛋鸡,蛋清中溶菌酶活性检测结果表明,pOV2LYZ的表达水平优于pOV1LYZ,因此作为进一步研究的表达载体。 将16只产蛋鸡随机分成2mg/1次、2mg分2次、3mg/1次和4mg/1次4个试验组,以翅静脉为途径分别注射经PEI包被的重组载体pOV2LYZ。根据注射鸡体温等生理指标及产蛋率的变化和蛋清中重组酶的表达检测,确定2mg重组载体分
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