死亡时间(time of death)的推断一直是法医病理学研究的热点和难点。死亡时间又称死后经历时间(Postmortem Interval, PMI),即发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。依据尸体死后变化发生的先后及法医学实践的需求,通常将死亡时间分为早期死亡时间和晚期死亡时间。二者以死亡24h左右为界限。显然,相对于晚期死亡时间,早期死亡时间推断的准确性对于实际检案意义更为重大。然而,目前能够应用于实践的早期死亡时间推断方法仍然只有利用早期尸体现象(尸冷、尸斑、尸僵、超生反应等)及胃内容物的消化程度等较为粗糙的经验性、主观性方法。在实验室研究方面,死亡时间推断的研究涉及多个学科和领域,如测定血液、玻璃体液离子浓度变化的化学方法、观察组织形态变化的免疫组化方法、研究动植物生长发育规律的法医昆虫学和法医植物学方法、利用CT、MRI、MRS的影像学方法以及通过研究核酸、蛋白质的时间依赖性降解的分子生物学方法。其中,在分子生物学领域,利用核酸特别是mRNA的时间依赖性降解推断死亡时间是近年来的研究热点。目前多数学者认为mRNA的降解与死亡时间之间存在着良好的相关性,可以成为晚期死亡时间推断的研究指标。然而在死亡早期,mRNA的降解不明显,不适合用于早期死亡时间推断。笔者认为,mRNA作为一种稳定性不高的核酸,在死后24h内不发生明显的降解这一观点值得怀疑。因为早期核酸测定只能通过免疫印记和Rt-PCR等半定量的方法,因此无法测得mRNA含量的微小甚至是较大的变化。同时,早期的研究在消除个体差异上也欠缺严谨性,研究表明,不同个体相同组织内的mRNA含量是可能存在较大差异的。针对以上两点,本实验应用实时荧光定量PCR这一更为精确的检测方法,并通过从同一个体上反复取材的方法以消除个体差异,进一步研究mRNA在死亡早期的降解情况,寻找其降解与早期死亡时间之间的关系,为早期死亡时间的推断提供新的研究手段。本实验分为三部分。第一部分是从大鼠脑、心肌、肾组织抽提总RNA。方法是将大鼠处死后置于20℃的环境中,在死后Oh、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h、72h和96h 11个时间点对每组的每个个体进行11次取材,对各时间点的所有捡材立即进行总RNA的抽提。将所提取的总RNA用20μ1DEPC水溶解。用Nano Drop 1000测定所抽提RNA在260nm和280nm处的吸光度(A)值及浓度值,用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。结果显示所有样品的A260/A280比值均在1.8～2.0之间,浓度值介于500ng/μl～3000ng/μl之间。琼脂糖凝胶电泳显示所有样品的完整性良好。第二部分是对提取的总RNA样本进行基因组DNA(genomic DNA, gDNA)的去除。方法是用DNase I对总RNA溶液进行消化,然后用苯酚/氯仿灭活DNase I并重提RNA。对重新提得的RNA用Nano Drop 1000检测其RNA在260nm和280nm处的吸光度(A)值及浓度值,用Rt-PCR检测去除基因组前后的扩增差异。结果显示去除gDNA的样本,A260/A280比值均在2.0～2.1之间,浓度值相对于去除前发生了明显的下降,说明去除基因组操作使总RNA得到进一步的纯化,但同时也发生了RNA量的损耗。Rt-PCR结果显示去除gDNA之前的样本均出现了不同程度的gDNA的扩增条带,而去除之后的样本均未出现杂质条带。第三部分是对去除gDNA的总RNA样本进行P-actin mRNA浓度的测定。方法是用实时荧光定量Rt-PCR。检测结果显示在死亡早期,脑、心肌、肾三个组织内β-actin mRNA的水平均发生了显著的下降,且各组织内β-actin mRNA的降解与死亡时间之间存在良好的线性关系。针对之前研究mRNA的时间依赖性降解规律中存在的测定方法不够精确和可能存在的个体差异问题,本课题首次设计了从同一个体反复取材的取材方法,使用目前最为精确的实时荧光定量PCR技术,专门研究了mRNA的降解和早期死亡时间之间的关系,证实了大鼠死亡早期脑、心肌和肾组织内β-actin mRNA降解明显并存在良好的线性关系,可以通过它的降解来推断早期死亡时间。