目的　　细胞各种功能的实现依赖于细胞外微环境提供的各种条件和刺激信号。细胞外基质(extracellularcellmatrix，ECM)是细胞外微环境的主要成分，包括一些生长因子和酶类。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是细胞外一大类基质降解酶。膜型基质金属蛋白酶1(Membrane-type1matrixmetalloproteinases，MT1-MMPs)是一种膜锚定型基质金属蛋白酶，活化后的MT1-MMP能够降解细胞外基质成分，包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ胶原、纤连蛋白、纤维蛋白等，并且还参与血管形成，介导基质金属蛋白酶2(metalloproteinases2)的活化等作用。　　将Oct4、Sox2、c-Myc和K1f4四种外源性表达的转录因子转染至成纤维细胞中，使其重编程为具有胚胎干细胞样状态的诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPScells)。此类细胞在克隆形态、生长特性、基因表达和分化潜能等方面同胚胎干细胞（embryonicstemcells，ESCs）及其相似。iPS细胞由于具有与ESCs一样的优势和分化特性，且可以避免免疫原性、伦理问题等的限制，故在细胞替代治疗及再生医学等临床治疗上具有有良好的应用前景。　　本实验通过将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种外源性表达的转录因子转染至C57BL/6J和MT1-MMP基因敲除鼠的成纤维细胞中，使其重编程为诱导多能干细胞，并对其增殖、粘附、凋亡和向内皮细胞分化功能进行检测和分析，探讨MT1-MMP基因缺失后对iPS细胞的增殖和向内皮细胞分化功能的影响。　　方法　　1、iPS细胞的制备和鉴定:将pMXs-Oct3/4、-Sox2、-c-Myc和-Klf4四种质粒在大肠杆菌扩增、提取;Plat-E细胞系包装培养、收集上清液;提取C57BL/6J小鼠和MT1-MMP基因敲除小鼠的成纤维细胞以密度8x104/ml细胞数接种于100mm的培养皿中，加入pMXs-Oct3/4、-Sox2、-c-Myc和-Klf4四种质粒包装成病毒的上清液，放入37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，每天换液一次，两天后接种到铺有SNL细胞的培养皿中，隔天换液。在光学倒置显微镜下观察转染后的克隆形成情况，挑取克隆，传代培养，观察iPS细胞的形态，碱性磷酸酶染色法鉴定iPS，免疫荧光检测iPS细胞的ES细胞特异性标志SSEA-1及Oct3/4的表达。　　2、MTS法检测增殖用MTS试剂盒检测两种iPS细胞的增殖情况。　　3、细胞粘附检测将两种iPS细胞以相同起始密度铺于培养盘中，放至37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，每隔1.5h取出一组细胞，弃去上清后用MTS试剂盒处理并用光学倒置显微镜观察拍照。　　4、Tunel法检测细胞凋亡用Tunel细胞凋亡试剂盒检测两种细胞的凋亡情况，并在光学倒置显微镜下拍照。　　5、MT1-MMP基因敲除小鼠iPS和C57BL/6J小鼠iPS细胞的诱导分化及体外微管腔形成分别将两种细胞的密度调整为2x104/孔接种于24孔板中，加内皮细胞诱导分化培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，每隔1d换一次新鲜诱导液，连续培养4d。用体外血管生成试剂盒，观察诱导分化4d后的细胞在半固体Matrix上形成微管腔结构的能力。将Matrix置于4℃融化，48孔板每孔铺100ulMatrix，将诱导4d的两种iPS细胞以4x104个/孔的细胞密度接种至半固体Matrix上，37℃、5％CO2饱和湿度条件下孵育5d，于光学倒置显微镜下观察拍照。　　结果　　1、iPS细胞的制备与鉴定　　(1)细胞形态学观察转染了Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子的C57BL/6J和MT1-MMP基因敲除的成纤维细胞，约两周后形成细胞克隆，挑取克隆，传代培养后可见ES样细胞克隆形式。　　(2)碱性磷酸酶染色用碱性磷酸酶试剂盒对传代后两种iPS细胞进行染色，稳定转染后的细胞呈蓝紫色。　　(3)免疫荧光染色两种iPS细胞明显表达ES细胞的特异性抗体SSEA-1和Oct3/4。　　2、MT1-MMP基因缺失对iPS细胞的增殖功能的影响　　用MTS法测定MT1-MMP基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠的iPS细胞的增殖情况，结果显示，MT1-MMP基因敲除组的细胞增殖能力明显高于C57BL/6J小鼠iPS细胞组的细胞。(P＜0.05)　　3、MT1-MMP基因缺失对iPS细胞的粘附功能的影响　　通过MTS法测定MT1-MMP基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠的iPS细胞的的粘附功能，结果表明MT1-MMP基因敲除组的细胞粘附能力强于C57BL/6J小鼠iPS细胞，且在光学倒置显微镜下观察，基因敲除组的iPS细胞贴壁数量多于C57BL/6J小鼠iPS细胞，细胞延展能力亦强于C57BL/6J小鼠iPS细胞(P＜0.05)。　　4、MT1-MMP基因缺失对iPS细胞的凋亡的影响　　用TUNEL试剂盒检测MT1-MMP基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠的iPS细胞的的凋亡情况，MT1-MMP基因敲除组的iPS细胞凋亡少于C57BL/6J小鼠iPS细胞(P＜0.05)。　　5、MT1-MMP基因缺失对iPS细胞的内皮分化及体外微管腔形成功能的影响　　通过检测内皮细胞的早期分化标志物Flk-1，发现，MT1-MMP基因敲除的iPS细胞经过应用内皮细胞诱导分化培养后，Flk-1的阳性表达率高于C57BL/6J小鼠的iPS细胞，但两组差异无统计学意义。将分化的细胞置于半固体Matrix上继续培养5d，可见MT1-MMP基因敲除小鼠iPS细胞的微管腔形成数量多，且管腔结构较好，而C57BL/6J小鼠iPS细胞的微管腔形成数量少，管腔结构形成差。(P＜0.05)　　结论　　1、MT1-MMP基因缺失导致小鼠iPS细胞的增殖能力、细胞粘附能力明显增强。　　2、MT1-MMP基因缺失导致小鼠iPS细胞凋亡明显降低。（P＜0.05）。　　3、MT1-MMP基因缺失导致由iPS细胞分化的内皮细胞微管腔形成能力增强。