目前致突变菌株(mutator strain)的使用是蛋白质定向进化中所采用的一种体内分子生物学方法。多数致突变菌株的构建都是通过破坏正常细胞的DNA复制和修复过程中的关键酶基因，使正常的DNA复制过程受到影响，忠实性和正确性降低，当外源目的基因转入到构建好的致突变菌株中时，发生随机突变的几率远远高于野生型，再通过有选择性的筛选，获得符合要求的突变子。因此，致突变菌株就是一种体内定向进化的突变系统和工具。 原核生物致突变菌株的研究目前已经很成熟，并且商品化。比如Stratagene公司生产的大肠杆菌XLl Red Competent cell。通过分子生物学的方法使XLl Red的DNA修复过程中的三个酶基因(错配修复基因、DNA 聚合酶Ⅲ 3′-5′核酸外切酶基因和8-OXodGTP水解酶基因)缺失，导致DNA复制过程的忠实性和正确性降低，这使得XLl Red致突变菌株的随机突变率是野生型的5000倍。该致突变菌株的优点在于可以在体内使目的基因发生随机突变，并且无需大量的遗传学和分子生物学操作。 虽然以大肠杆菌xLl Red为代表的原核生物致突变菌株在体内定向进化中取得了一些结果，但是大多数的致突变菌株不能够根据需要控制合适的突变率，同时作为原核生物表达系不适合某些真核生物蛋白的表达，这些因素限制了该项技术的广泛应用。为克服传统致突变菌株的这些缺陷，本课题分别敲除了酵母菌RDKY3615(ura3-52，trpl△63，leu2△1，his3△200)中与清除活性氧化物质(reactive oxygen species)有关的三个酶——超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CTT和硫氧还蛋白SRX的基因，构建了三株可以通过不同的H<,2>o<,2>诱导处理条件来控制突变率的致突变菌株RDKY3615(△sod)、RDKY3615(△ctt)、RDKY3615(△srx)。 该致突变菌株相对于传统的致突变菌株来说具有两个特点：第一，它是真核生物体系，而真核致突变菌株应用于体内定向进化的研究还未见报道；另外本文所构建的三株致突变菌株是通过敲除掉与清除活性氧化物质有关的三个酶基因而建立的，如此，相对于野生型来说，致突变菌株的DNA被氧化损伤发生突变的几率要高于野生型(Molecular Cell，Vo1.17，709-720，March 4，2005)，并且可以通过人为的改变氧化型诱导剂H<,2>O<,2>的处理条件来控制致突变菌株的突变率，实现了致突变菌株在突变率上的可控性。本论文在成功构建的三株致突变菌株基础上，通过报告质粒中kanamycin抗性基因的回复突变，确定了H<,2>O<,2>浓度和处理时间对突变率的影响，并以瑞氏木霉内切纤维素酶EGⅢ作为模式蛋白开展了体内蛋白质定向进化的尝试工作。实验结果表明该真核致突变菌株可应用于体内蛋白质定向进化的工作。