【摘 要】
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血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype4,FAdV-4）属于腺病毒科、禽腺病毒属,无囊膜的双链DNA病毒。自从1987年在巴基斯坦报道了肝炎-心包积液综合征以来,FAdV-4逐渐向周边国家蔓延扩散。2015年以来,国内鸡群大面积暴发由高致病性FAdV-4感染引起的肝炎-心包积液综合症。鸡群感染FAdV-4后主要表现为心包积液、肝炎、肾炎,发病率和死亡率高达30%～80%
【基金项目】
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江苏省农业科技自主创新资金项目（编号:CX（19）3026）； 扬州市科技计划（现代农业）重点研发项目（编号:YZ2020051）；
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血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype4,FAdV-4）属于腺病毒科、禽腺病毒属,无囊膜的双链DNA病毒。自从1987年在巴基斯坦报道了肝炎-心包积液综合征以来,FAdV-4逐渐向周边国家蔓延扩散。2015年以来,国内鸡群大面积暴发由高致病性FAdV-4感染引起的肝炎-心包积液综合症。鸡群感染FAdV-4后主要表现为心包积液、肝炎、肾炎,发病率和死亡率高达30%～80%,对养禽业造成巨大的经济损失。然而,目前对高致病性FAdV-4的致病机制知之甚少,且国内尚无获批的商品化疫苗。虽然Zhang等人发现高致病性FAdV-4的纤突蛋白Fiber-2和六邻体蛋白与病毒的致病性密切相关,但其分子机制尚待解析。本研究靶向致病因子Fiber-2蛋白,开展FAdV-4的致病分子机理研究,并进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对致病因子Fiber-2进行编辑,开发针对FAdV-4弱毒活疫苗。1、血清4型禽腺病毒纤突蛋白Fiber-2与宿主蛋白KPNA3/4互作为了探究FAdV-4纤突蛋白Fiber-2的致病分子机制,本研究利用Fiber-2的单抗,通过免疫共沉淀、银染和质谱测序等技术进行了 Fiber-2互作蛋白鉴定及其功能研究。结果筛选发现FAdV-4纤突蛋白Fiber-2能与宿主蛋白KPNA3/4进行直接互作。研究证明过表达KPNA3/4能够促进病毒的复制,而敲除KPNA3/4可以在早期抑制病毒的复制,表明病毒能够劫持宿主蛋白KPNA3/4有利于病毒的复制。进一步的表位鉴定发现,纤突蛋白Fiber-2与KPNA3/4互作的表位落在纤突蛋白N端1-40位氨基酸之间。通过对不同毒力的FAdV-4毒株的纤突蛋白Fiber-2序列比对发现,与高致病性毒株比较,低致病性毒株N端1-40位氨基酸之间存在不同的缺失或点突变。Fiber-2与宿主蛋白KPNA3/4互作及其互作位点鉴定,KPNA3/4对FAdV-4复制的影响,为进一步研究Fiber-2在血清4型禽腺病毒的致病中作用及分子机制提供了靶点。2、血清4型禽腺病毒纤突蛋白Fiber-2与KPNA3/4互作的N端显著影响病毒致病性为了探究纤突蛋白Fiber-2与宿主蛋白KPNA3/4互作是否影响病毒的致病性,本研究利用CRISPR/Cas9技术对FAdV-4基因组进行编辑,构建以删除纤突蛋白Fiber-2与KPNA3/4的互作表位的FAdV-4变体。在构建过程中,首先利用CRISPR/Cas9技术拯救出Fiber-2与EGFP融合的重组病毒FA4-EGFP,随后再次通过基因编辑技术,将EGFP删除的同时把Fiber-2与KPNA3/4的互作表位进行删除,最终获得缺失互作表位的重组病毒FAV4-Del。进一步的动物试验证明,与野生型FAdV-4比较,插入EGFP的重组病毒FA4-EGFP和缺失互作表位的重组病毒FAV4-Del在SPF鸡中都表现为高度致弱,完全不致病。更重要的是,两个重组病毒都可以有效的刺激机体产生高水平的中和抗体,对高致病性FAdV-4攻毒提供完全的免疫保护。以上缺失Fiber-2与KPNA3/4互作表位的重组病毒FAV4-Del高度致弱不仅明确了 Fiber-2与KPNA3/4互作表位N端7-40位氨基酸直接影响FAdV-4致病性,而且为有效防控FAdV-4提供了弱毒疫苗候选毒株。同时,重组病毒FA4-EGFP的成功构建及其致弱特性为创制FAdV-4基因工程疫苗载体提供了插入外源基因位点,为进一步构建多联疫苗打下坚实的理论基础。3、血清4型禽腺病毒纤突蛋白Fiber-2对病毒组装和攻毒保护为非必需纤突蛋白Fiber-2作为FAdV-4的主要结构蛋白之一,研究表明重组的纤突蛋白Fiber-2能够为SPF鸡群提供比其他结构蛋白包括纤突蛋白Fiber-1、五邻体基底和六邻体蛋白更好的保护力。然而,相比于全病毒灭活疫苗,纵然免疫重组纤突蛋白Fiber-2能够为鸡群提供良好的保护力,但是却不能刺激机体产生中和抗体。因此,我们大胆猜测纤突蛋白Fiber-2可能不是FAdV-4必需的。为了验证我们的猜测,本研究利用CRISPR/Cas9技术用EGFP将Fiber-2进行替换,尝试拯救缺失Fiber-2的重组病毒。缺失Fiber-2的重组病毒FAV4-EGFP-rF2的成功拯救证明了 Fiber-2不是FAdV-4病毒组装必需的。进一步的动物试验表明,缺失Fiber-2的重组病毒FAV4-EGFP-rF2表现为高度致弱,但是却能够为高致病性FAdV-4攻毒提供完全保护。以上缺失Fiber-2的重组病毒FAV4-EGFP-rF2的成功构建明确了 Fiber-2不仅不是FAdV-4病毒组装必需,而且也不是FAdV-4攻毒保护必需。同时,重组病毒FAV4-EGFP-rF2的成功构建及其致弱特性进一步证明了纤突蛋白Fiber-2的位置可作为其他病原保护性抗原的插入位点,为构建基于FAdV-4的多联基因工程疫苗提供了可能。
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