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SARS-CoV为一种新发现的人冠状病毒，属于单股正链RNA病毒，基因组全长约30kb，是已知的RNA病毒中基因组最大的一类病毒。SARS-CoV基因组结构为5’-Rep-S-E-M-N-3’，编码4种结构蛋白和多种非结构蛋白。其中刺突蛋白S为病毒最重要的结构蛋白，参与病毒与细胞受体的结合以及入侵宿主细胞的膜融合过程，决定着病毒的组织嗜性和毒力。 目前对SARS-CoV基因组结构与功能、致病的分子机理并不十分清楚，对于病毒基因组中与毒力相关的位点大多为生物信息学预测，确切的毒力位点尚未得到实验验证。由于SARS-CoV基因组较大而难以构建感染性克隆进行体外突变研究，因此构建病毒基因组全长cDNA可有效解决这一问题，为深入探讨SARS-CoV的基因组结构与功能、致病的分子机理奠定基础。 为此，本研究采用分段克隆、体外拼接策略构建了SARS-CoV BJ01株基因组全长cDNA，经体外转录制备了恢复病毒，观察了恢复病毒对敏感细胞的感染性及传代稳定性；并通过生物信息学方法对BJ01株S蛋白的可能毒力相关位点进行了分析预测和体外突变，构建了突变病毒全长cDNA。进一步观察比较突变病毒的感染性与原型病毒的差异，为寻找SARS-CoV毒力位点和揭示其致病的分子机制提供依据。 首先，构建了本实验室分离的SARS-CoV BJ01株病毒基因组全长cDNA。鉴于冠状病毒基因组较大，设计覆盖病毒全基因组的7对引物将病毒全长cDNA分为7个片段分别进行了扩增。获得的F1～F7各cDNA片段大小分别为1.5kb，2.8kb，4.3kb，3.3kb，6.8kb，4.5kb和6.3kb。同时，为实现全长cDNA的体外转录，在病毒基因组5′端引入T7启动子核心序列。将7个cDNA片段分别克隆至pGEM-T Easy、pCR-XL-TOPO、pWSK29等不同载体，构建了BJ01株cDNA亚克隆。然后酶切重组质粒制备目的片段，分别将F1～F4和F5～F7体外连接获得基因组5′和3′半分子cDNA，再将二者进行体外连接构建BJ01株全长cDNA分子。接头处序列的测序结果表明获得了SARS-CoV BJ01株基因组全长cDNA。