核酸分析检测对生命科学基础研究、人类健康具有重要意义。传统聚合酶链式反应(PCR)依赖热循环仪,不适合在偏远、贫穷、没有相关仪器的地方进行检测。核酸等温扩增技术不依赖于精良设备,在现场和临床快速诊断中展示了良好的应用前景。然而,当前等温扩增技术在灵敏度、特异性和适用范围方面仍存在着一些问题。CRISPR/Cas系统作为一种源自原核生物获得性免疫系统的基因定点编辑技术,自发现以来吸引了大量科研关注,近年来被广泛应用于临床核酸分析检测及生物传感技术。本文利用CRISPR/Cas蛋白独特的核酸切割活性,分别开发了 microRNA快速检测和核酸恒温扩增检测新方法。首先,我们利用Cas12a蛋白的反式切割活性,开发了一种多酶级联反应方法应用于microRNA(miRNA)特异性检测。靶标miRNA存在时,RNA连接酶引发连接反应生成包含T7启动子的转录模板,T7 RNA聚合酶转录合成大量含有crRNA和8-17E脱氧核酶底物的RNA序列,8-17E脱氧核酶特异性切割RNA序列生成crRNA和与靶标miRNA序列相同的RNA。crRNA与Cas12a结合后,反应体系中游离的双链DNA分子特异性激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性,导致单链荧光探针被切割而产生荧光,通过检测荧光信号实现miRNA定量分析。该方法的检测限达21.9fM,并能够应用于不同细胞裂解液中miRNA的定量分析。第二,我们制备了 Cas9n-Klenow融合蛋白,以改进本课题组建立的双酶(CRISPR Cas9n及DNA聚合酶)偶联的通用等温DNA扩增方法(Cas9nAR)。构建表达Cas9n-Klenow融合蛋白的质粒,并进行体外表达和纯化,证明融合蛋白同时具有切口酶和聚合酶活性。两组sgRNA:Cas9n-Klenow复合物分别与原间隔子相邻基序(PAM)毗邻的靶DNA序列结合后,通过融合蛋白的单链切口活性和链置换活性得到一条靶ssDNA序列。该序列在带有Cas9n裂解序列的引物1和2以及sgRNA:Cas9n-Klenow复合物的共同作用下,经过引物杂交、延伸、切刻和置换反应的循环过程获得大量靶dsDNA序列。添加SYBR Green I荧光染料与dsDNA产物结合产生荧光信号,荧光强度与dsDNA产物浓度成正比。利用Cas9n-Klenow融合蛋白在37℃恒定温度下成功扩增靶序列,证明其可应用于Cas9nAR方法中。