研究背景及目的结直肠癌是一种常见的消化系恶性肿瘤,其发病率呈逐年上升趋势,目前主要以手术治疗为主,术后化疗的失败是肿瘤发生转移和复发的主要原因,因此,寻求有效地治疗靶点,阻止耐药的产生,显得尤为重要。目前研究表明,许多生长因子如表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)在肿瘤的发生发展中扮演重要角色.近年研究发现一种新的生长因子,即肝癌衍生生长因子(hepatoma-derived growth factor, HDGF),因其在许多生理病理过程中起重要作用,已受到越来越多研究者的关注。HDGF在多种恶性肿瘤如肝癌、肺癌和胃癌中的表达水平显著高于正常组织,并且HDGF表达越强的肿瘤,其恶性程度越高。这些研究暗示：HDGF与这些恶性肿瘤的形成和发展密切相关。为了弄清HDGF在结直肠癌的疾病演进发展及化疗耐药中是否起作用?本课题做了如下研究：第一部分利用免疫组化法,检测HDGF在正常结直肠粘膜、结直肠炎、结肠腺瘤及结直肠癌组织中的表达情况,并分析HDGF与抗凋亡因子生存素(Survivin)在结直肠癌组织中表达的临床意义以及两者的关系。第二部分利用RNA干扰技术抑制HDGF基因,观察该基因下调对结直肠癌细胞增殖及凋亡的影响。第三部分利用基因工程技术将人重组含HDGF全长DNA的质粒转入细胞,从而构建稳定过表达HDGF的细胞株,并观察HDGF过表达是否影响肿瘤细胞对化疗的敏感性。方法1.应用免疫组化S-P法检测结直肠组织(结直肠腺癌120例,大肠腺瘤28例,结直肠炎17例及正常组织11例)中HDGF的表达,以及Survivin在结直肠癌中的表达,并进行统计分析。2.应用RNA干扰技术沉默HDGF基因,利用MTT法观察抑制HDGF基因前后结直肠癌细胞增殖能力的变化,通过流式双染,DNA Ladder, Hoechst 33258荧光染色等方法检测转染前后细胞凋亡变化,运用免疫印迹法检测转染HDGF-si RNA前后相关凋亡蛋白的变化情况。3.运用基因工程技术,构建包含人HDGF基因全长序列的真核表达载体。经G418抗性筛选获得稳定表达的细胞株LoVo/HDGF。MTT检测各组细胞在化疗药物NDGA (不同浓度,不同作用时间)处理后生存率的变化,流式双染检测各组细胞在NDGA处理后的凋亡率,成瘤试验检测各组移植瘤在化疗药物NDGA作用下的生长情况结果1. HDGF蛋白水平在结直肠正常粘膜、炎症、腺瘤及腺癌四种不同疾病阶段组织中的表达水平是依次逐渐升高。HDGF与survivn在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为59.2%和60.8%。两者表达与患者的年龄、性别、肿瘤分布部位、肿瘤大小及浸润深度均无关(p值均大于0.05)。HDGF的高表达与肿瘤临床病理分级、淋巴结转移和Dukes分期有关(p<0.05)；Survivin的表达则与有无淋巴结转移和Dukes分期有关(p<0.05)。Spearman等级相关显示二者之间呈正相关。2.与两个对照组相比,HDGF-siRNA处理组：细胞增殖能力下降,细胞凋亡明显增多；细胞中PCNA蛋白、pERK1/2蛋白、bcl-2及Survivin蛋白含量均有明显下调而Bax明显上调、Cyt-c从线粒体释放到胞浆、caspase-9及caspase-3被激活。3. NDGA对三组细胞均有杀伤性,且随浓度增加及作用时间延长而杀伤力增大。与mock组及LoVo组细胞相比,LoVo/HDGF细胞在NDGA处理后的生存能力明显增强,抗凋亡能力增强,体外成瘤试验也证实了LoVo/HDGF细胞抵抗NDGA的能力强于其它两个对照组。结论HDGF在结直肠癌的发生、进展过程中可能扮演重要角色；HDGF的高表达与肿瘤临床病理分级、淋巴结转移和Dukes分期有关(p<0.05); HDGF与survivn在结直肠癌组织中的协同高表达暗示两者可能相互作用,共同参与了结直肠癌恶性生物学行为。由此可见HDGF是一个理想的结肠肿瘤标志物,对于判断预后有着重要的意义。此外,HDGF-siRNA能明显抑制肿瘤细胞生长并诱导其发生凋亡,因此,HDGF是结直肠癌基因治疗的一个很好的分子靶点。不仅如此,本研究还显示HDGF能导致结直肠癌细胞对化疗药物NDGA的杀伤作用产生一定的抵抗,这暗示HDGF可能参与了化疗耐药中的重要环节,对于解决化疗耐药问题有着重要的意义。