本文所述的工作主要分为两部分，第一部分为来源于不同种属的色氨基酰-tRNA合成酶催化机制，进化途径和药物设计等方面的研究，第二部分为von Willebrandfactor调控机制的研究。　　 氨基酰--tRNA合成酶(Aminoacyl-tRNA synthetase，aaRS)是在蛋白质合成过程中负责催化将特定的氨基酸激活并转移到相应的转运核糖核酸(tRNA)分子的氨基酸接受臂上的酶家族。氨基酰--tRNA合成酶(Tryptophanal-tRNA synthetase，TrpRS)高度特异性地激活相应氨基酸为保证蛋白质的正确翻译提供了保障。它属于Ic类氨基酰tRNA合成酶，为色氨酸进入蛋白质合成途径提供了界面。　　 aaRS是进化史中一类古老的酶类，是研究早期进化事件的很好的模型。目前为止，色氨基酰--tRNA合成酶和酪氨基酰--tRNA合成酶(Tyrosyl-tRNA synthetase，TyrRS)的进化关系仍然存在争议。由于这两种氨基酰--tRNA合成酶在序列上差异较大，但具有很高的结构相似性，所以基于结构的进化分析可能更适合研究这两个酶的进化关系。因此，我们解析了来源于古细菌代表一掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)的TrpRS和其底物TrpAMP复合物的晶体结构。基于这个结构，我们进行了一次较为完整的基于结构的进化分析，首次包含了来源于三界的TrpRS和TyrRS的晶体结构。分析显示，这两种酶单独的进化树和以前报道的基于序列的进化树是一致的。但是，在研究这两种酶的进化关系时发现，来源于古细菌/真核的TyrRS和所有的TrpRS更为相似，而和来源于细菌的TyrRS较为不相似。这个结果显示了TrpRS起源于TyrRS的古细菌分支上。而且TrpRS和古细菌TyrRS在进化树上的较短距离，以及TrpRS的广泛分布，共同说明了TrpRS的出现是一个进化的早期事件。　　 基于我们实验室之前对于人源TrpRS结构(hTrpRS)的解析和底物识别和催化机制的分析，我们进一步解析了低等真核生物酿酒酵母TrpRS(sTrpRS)的一系列晶体结构。在每个sTrpRS与配体结合的复合物结构中，我们发现均有一个硫酸根结合在底物活性口袋中，分析表明该硫酸根模拟了在色氨酸激活反应中底物ATP的磷酸根。值得一提的是，在sTrpRS与底物类似物的复合物结构中，该硫酸根捕捉到了在色氨酸激活过程中ATP的α磷酸根向色氨酸转移过程中的某一状态。进一步的分子动力学模拟结果表明，在色氨酸激活过程中，ATP的α磷酸根首先向色氨酸转移，先到达一个中间位置，这一位置与硫酸根结合的位置十分相似，然后继续移动，最终在距离亲核基团约2A处来回摆动。在此过程中，一个保守的精氨酸很可能在反应过渡态中与断裂的磷氧键中的氧相互作用，提示了该保守的精氨酸很有可能在亲核进攻中起了十分重要的作用。综上所述，真核生物的色氨基酰--tRNA合成酶很可能采取了associative的催化机制，而与原核生物的dissociative机制不同。另外，将未结合底物的sTrpRS结构与相应的hTrpRS结构相比，我们发现sTrpRS的活性口袋具有一个额外的小空腔，这一结构特征在治病真菌中具有较高的保守性，很有可能为今后设计针对TrpRS的抗真菌药物提供结构基础。　　 近年来的结构研究发现，真核生物和原核生物的TrpRS在底物结合和反应催化机制上有较大的差异，且抑制TrpRS会影响细菌的生长增殖。因此TrpRS被认为是发展新型抗生素的很好的药物靶标，早期研究表明，针对TrpRS的小分子抑制剂吲哚霉素对于细菌的生长生殖有抑制作用。我们解析了细菌大肠杆菌TrpRS(eTrpRS)与其小分子抑制剂吲哚霉素复合物的三维晶体结构。结构分析不仅揭示了吲哚霉素和eTrpRS底物结合口袋相互作用的关键残基，解释了吲哚霉素与原核TrpRS结合的高亲和力和对原核TrpRS的高选择性，并且为设计和改造吲哚霉素以得到具有更高亲和力、更高特异性的小分子抑制剂药物提供了结构基础。目前，一系列基于结构信息设计的小分子化合物正在合成，希望可以从中找到更适合的药物小分子前体。　　 血管性血友病因子(von Willebrand factor, VWF)是一种在正常凝血过程中起重要作用的多聚糖蛋白。VWF的多聚化程度对维持其正常的生理作用十分重要，VWF多聚体过多会导致血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，而过少会引起中度至重度出血倾向即血管性血友病(VWD)。VWF多聚体的大小由凝血酶敏感蛋白I型的金属蛋白酶ADAMTS13调控。ADAMTS13可以特异性酶切VWFA2结构域中Tyr1605与Metl606间肽键，从而防止血小板过多聚集。A2结构域的突变会引起VWF对于ADAMTS13敏感性增加，导致2A型VWD。由于A2结构域在大肠杆菌系统中表达难以正确折叠以包涵体形式存在，包涵体变复性不能得到均一状态良好的蛋白质，我们对它进行了一定的改造，人为引入了一个连接该结构域N端和C端的二硫键，以稳定A2结构域的稳定。我们解析了A2结构域二硫键突变体(N1493C/C1670S，ssA2)的结构，发现ssA2的结构与之前报道的wtA2结构域整体结构相似，只有α3-β4区域构象差异较大。在ssA2结构域中新发现一个金属离子结合位点，并且经过原子激发光谱(ICP-AES)和反常信号收集的方法证明该位点是一个钙离子结合位点。经过分子动力学模拟实验和一系列ADAMTS13酶切实验，我们证明钙离子的结合可以稳定A2结构域的三维结构，保护它不被ADAMTS13过早酶切，从而调节VWF在血液中剪切压诱导的酶解。