第一部分黄连素通过对c-Met和EGFR双重抑制发挥抗神经胶质瘤的作用研究背景在全球大多数发展中国家中,常常将具有药理性质的植化物作为主要的医用来源。其中黄连的主要组分黄连素(berberine),在中国已经使用了上百年。由于其毒性较低,临床用于许多疾病的预防和治疗,包括:胃肠道感染,腹痛和腹泻,高血糖和高血脂。然而,最近越来越多的研究表明,黄连素在各种不同的肿瘤细胞中具有抗肿瘤作用,如在神经胶质瘤和肺癌细胞中具有抗肿瘤作用。其作用机制也有诸多报道,如黄连素可以通过抑制DNA拓扑异构酶I,诱导细胞周期阻滞从而在体外发挥抑制增殖的作用,同时,黄连素也可以通过介导HER2/PI3K/AKT信号通路,激活caspases,并且诱导PARP-1的断裂从而发挥促进凋亡的作用。恶性神经胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤和最具侵犯性的人类肿瘤。近年来一些常见的治疗手段,如手术,放疗和化疗,仅仅只能有限的延长人类寿命,而大多数诊断为神经胶质瘤的患者平均生存周期仅为一年。最近的研究结果表明,神经胶质瘤共同表达HGF/SF和c-Met,并且c-Met可能作为脑肿瘤治疗干预有效的治疗靶标。当前越来越多的证据显示肿瘤起源于肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),它是一类未分化细胞,具有自我更新、无限增殖和分化的能力,能促使肿瘤组织形成和无限生长,CSCs往往对化疗抵抗并导致肿瘤转移和复发。因此,杀伤肿瘤干细胞对于成功治疗肿瘤至关重要。在肿瘤致瘤性实验中发现,c-Met为原癌基因,编码肝细胞生长因子或扩散因子的高度亲和力受体。c-Met信号通路的异常在大多数实体瘤中比较常见,如人类的神经胶质瘤,肺癌。c-Met的异常激活可以促进肿瘤的生长,生存,迁移和侵袭,同时也是维持胶质瘤干细胞多潜能性所必须,因此对肿瘤的发生发展至关重要[1]。c-Met激酶可以激活一系列的信号通路,如MAPK,PI3K和STAT3。而且,c-Met可以和其他的细胞表面受体特别是EGFR相互作用,并介导相同的下游信号通路。约50%的神经胶质瘤患者中,EGFR都出现了过表达,并且在临床治疗过程中已经成为了神经胶质瘤治疗的主要靶点。然而,由于EGFR靶向药物的普遍应用,患者的耐药性也逐渐产生。有报道表明,患者出现耐药性的一部分原因是由于EGFR和c-Met之间的相互作用导致的。抑制EGFR信号通路,同时也可能激活c-Met信号通路,从而产生耐药性,导致治疗失败。因此,同时靶向EGFR和c-Met对于神经胶质瘤患者的治疗至关重要。可惜的是,目前为止临床上尚无针对c-Met的靶向抑制剂,更没有同时针对c-Met和EGFR的双靶点抑制剂.本研究主要是探讨黄连素对神经胶质瘤细胞的作用及作用机制。我们发现黄连素可以在体外抑制神经胶质瘤细胞的增殖,同时诱导凋亡,其作用机制主要是双重抑制酪氨酸激酶受体c-Met和EGFR的表达,并下调二者下游的信号分子AKT,ERK和STAT3等的活性。黄连素在裸鼠体内也可以抑制肿瘤的生长,同样可以抑制EGFR和c-Met信号通路级联反应。因此,我们的实验结果为黄连素治疗神经胶质瘤患者的临床应用提供了重要的证据。研究目的1.研究黄连素对神经胶质瘤的作用2.探索黄连素抑制神经胶质瘤的作用机制3.研究黄连素对肿瘤干细胞的作用4.体内试验验证黄连素的抗肿瘤作用材料和方法化学试剂和抗体:黄连素购于南京艾斯提么中药研究所。将黄连素溶于DMSO至30 mg/mL的储存浓度,并存于4摄氏度不超过两个月。用于Western blot检测EGFR,p-Met(Tyr1 234/1235),AKT1/2/3,p-ERK(Thr202/Tyr204)和 ERK1/2 的一抗购于美国的cell signaling公司,c-Myc和Cyclin D1的一抗购于美国的Abcam公司,p-Akt(Ser473),c-Met,p-STAT3(Tyr705),p-STAT3(Ser 727),STAT3 和 β-catenin购于美国的桑塔公司。细胞培养:所有的细胞都是由本实验室保存。神经胶质瘤细胞系主要是培养在DMEM培养基中,并补以百分之十的胎牛血清。肺癌细胞株H1975细胞株都是保存于RPMI1640培养基中,并补以百分之十的胎牛血清,在37℃,5%C02和95%空气的恒温箱中进行培养。MTT实验:细胞消化并以3000-5000每孔的细胞密度种于96孔板中培养24小时。当用不同浓度的黄连素处理24,,48和72小时后,每孔加入20微升5 mg/ml的MTT在37摄氏度孵育四小时后,将100微升的DMSO加入到96孔板中溶解甲攒晶体,然后在490nm波长处测定吸光值。EdU实验:U87和U251细胞以每孔8000个细胞的密度种于96孔板中培养24小时贴壁之后,加入不同浓度的黄连素进行处理,当培养24小时后,用EdU实验按照说明书的指导方法检测处于S期的细胞。流式检测凋亡细胞:所有的细胞以1 ×105的起始细胞密度种于60-mm的小皿中进行培养。当细胞密度达到70-80%时,加入不同浓度的黄连素处理48小时。凋亡实验采用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶双染凋亡检测试剂盒按照试剂盒的指导进行细胞处理,然后用流式仪器进行凋亡检测。简而言之,就是先将细胞进行消化,离心,并用PBS清洗两次,再用500微升的膜联蛋白结合缓冲液进行重悬。然后加入5微升的膜联蛋白V-FITC溶液室温孵育5分钟,最后加入V-FITC再孵育5分钟。细胞悬液于一个小时之内用流式仪器进行检测。肿瘤球培养实验:无血清培养基配制:无血清培养基(serum free medium,SFM)由Ham’s DMEM-F12(1:1)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)组成,将胶质瘤细胞U87和U251接种于10%胎牛血清的DMEM培养基中,待细胞处于对数生长期时,用PBS液清洗,胰酶消化,消化后再用PBS清洗两次,置于低粘附培养板中,悬浮于无血清培基中进行传代培养。Aldefluor 实验:将贴壁细胞或肿瘤细胞分离成单个细胞,将细胞悬浮于反应缓冲液中,调整细胞浓度为lx 106个/mL,向其中加入4%多聚甲醛进行固定4h后,再加入0.3%Triton进行通透过夜后,用PBS洗三次,再加入一抗ALDH孵育过夜,用PBS洗三次后,加入荧光二抗1h后,用流式检测。蛋白免疫印记实验:细胞在不同的时间段用不同浓度的黄连素进行处理一定时间后,提取总蛋白。首先倒掉培养液,并将培养皿倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液。每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS(0.01MpH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。按1ml裂解液加10ulPMSF(1OOmM),并加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(比例为1:100),摇匀置于冰上。于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养皿要经常来回摇动。裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养皿的一侧,然后用枪将细胞碎片和裂解液移至EP管中。于4度下12000rpm离心5min。将离心后的上清分装转移倒EP管中,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,根据说明书进行浓度测定。进行浓度测定时,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。将样品到96孔板的样品孔中,加用于稀释标准品的溶液到20μl。各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置30分钟后,测定572nm波长处的吸光值,根据标准曲线计算出蛋白浓度。将等量的蛋白样品(30微克)用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,然后用电转移转移至PVDF膜中,然后用特定蛋白的一抗孵育,4摄氏度下孵育过夜,再用结合有辣根酸过氧化物酶的二抗常温条件下缓慢孵育一个小时。最后阳性的免疫反应用ECL合免疫印迹检测系统进行检测。裸鼠异种移植实验:所有的裸鼠均购于广东省动物中心。总共1.5×106个神经胶质细胞U87细胞皮下种植于4-5周的雌性裸鼠的腋下,一周后,对照组的裸鼠注射PBS,而处理组的裸鼠以15 mg/kg的剂量腹腔注射黄连素,肿瘤的大小用游标卡尺每天进行测量,肿瘤体积按照长×宽2/2进行计算,当肿瘤的体积生长到一定的体积之后将裸鼠进行颈椎离断。免疫组化:将皮下种植的肿瘤从裸鼠体内取出来以后,用4%的多聚甲醛进行固定,然后脱水,石蜡包埋,连续切片之后,用苏木素和伊红进行染色。未染色的切片用免疫组化实验,将烤好的免疫组化片用梯度酒精进行水化,然后在柠檬酸溶液中高温进行抗原修复,再缓慢冷却至室温,用PBS清洗之后,用山羊血清封闭半个小时,用PBS稀释好的一抗加入到免疫组化片中于湿盒4摄氏度孵育过夜。用PBS清洗之后,再加入用PBS溶解的二抗常温孵育一个小时。用DAB作为色原检测免疫反应的结果。结果1.黄连素在体外抑制胶质瘤U87和U251细胞的增殖和促进细胞凋亡。1).通过MTT实验,我们发现随着黄连素浓度的增加和作用时间的延长,可以显著的抑制这两株肿瘤细胞的增殖。黄连素处理72小时后,细胞U87的平均IC50为32μg/mL,而细胞U251的平均IC50为20μg/mL。2).我们进一步用EdU实验检测黄连素对DNA合成的作用,EdU阳性的细胞即代表处于S期的细胞,结果表明,在神经胶质瘤细胞株中,随着黄连素浓度的增加,EdU阳性细胞的百分比显著减少。3).我们下一步检测黄连素对神经胶质瘤细胞凋亡的作用。将胶质瘤细胞U87和U251用不同浓度的黄连素处理48小时后,我们用流式细胞检测分析结合膜联蛋白V和PI染色来检测细胞凋亡的百分比。在低剂量的黄连素处理细胞之后,仅有少量的细胞凋亡。然而当使用60 μg/ml的黄连素进行处理之后,早期凋亡和晚期凋亡的细胞明显增加。2.黄连素抑制胶质瘤细胞肿瘤球的生长和ALDH阳性细胞比例。1).黄连素抑制胶质瘤细胞U87和U251肿瘤球的生长,处理组与对照组相比,肿瘤球的大小和个数均降低。2).与对照组相比,黄连素显著抑制胶质瘤细胞U251ALDH阳性细胞的比例。3.黄连素抑制神经胶质瘤细胞中c-Met和EGFR的信号级联反应。1).黄连素以时间和剂量依赖性的方式抑制c-Met和EGFR的表达。2).在神经胶质瘤细胞中,经黄连素处理后,EGFR和c-Met的主要下游信号分子—总的STAT3,p-ERK和p-AKT的表达也显著降低。4.黄连素在肺癌细胞中也显著下调c-Met和EGFR信号级联反应的表达在肺癌细胞中,随着黄连素浓度的增加,可以显著降低c-Met和EGFR信号通路级联反应的表达。5.黄连素在体内也有明显的抗肿瘤作用1).由于黄连素处理组中肿瘤的体重和体积与对照组相比明显降低,因此说明黄连素可以显著抑制肿瘤异种植入物的生长。然而黄连素处理之后的毒性是很低的,裸鼠的体重,还有心,肝,脾,肺,肾等器官的体重处理前后无明显的变化。2).与对照组相比,用黄连素处理之后的肿瘤组织中,EGFR和c-Met信号通路的表达量明显降低。结论1.黄连素通过抑制胶质瘤细胞的增殖和促进细胞的凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长。2.黄连素在体外抑制胶质瘤细胞肿瘤球的生长和ALDH阳性细胞的比例,从而有可能抑制胶质瘤干细胞的生长。3.黄连素通过下调EGFR和c-Met信号级联反应,从而抑制肿瘤细胞的生长。4.黄连素在体内也能显著抑制胶质瘤的生长。5.黄连素作为酪氨酸激酶受体c-Met和EGFR的双重抑制剂,可望成为神经胶质瘤患者的临床用药。第二部分黄连素通过抑制STAT3而增加肺癌细胞对阿霉素的敏感性黄连素是一种从中草药黄连中提取的生物碱成分,近几年,它的抗肿瘤活性引起了人们极大的兴趣。STAT3在肿瘤的恶性转化和发生发展中都起到重要的作用,在许多人类肿瘤中都得到固有激活。在本研究中,我们发现黄连素可以抑制肺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,并抑制肿瘤球的形成。这些作用可能与黄连素在肺癌细胞中抑制磷酸化和总的STAT3蛋白表达水平的作用密切相关,另外,黄连素通过增加STAT3蛋白的泛素化作用而促进其降解,更重要的是,我们发现黄连素可以抑制阿霉素在肺癌细胞中介导的STAT3的激活,并增加阿霉素对肺癌细胞的敏感性。由于黄连素毒性较低,在临床上广泛应用,我们的研究结果可能为黄连素和阿霉素在肺癌细胞中的联合应用提供了潜在的重要证据。