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端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，能够防止染色体之间末端融合，稳定基因组。在肿瘤细胞中破坏端粒动态平衡即缩短长度或者破坏结构，有望成为抗肿瘤治疗的新策略。沙尔威辛(salvicine，SAL)是中国科学院上海药物研究所从药用植物红根草中提取分离，并经化学修饰优化而得到的全新结构的二萜醌类化合物。SAL具有显著的体内外抗肿瘤活性，是一种新的非嵌入型DNA拓扑异构酶II(Topoisomerase II，Topo II)抑制剂，目前已进入临床I期研究，有望成为具有我国自主知识产权的一类抗肿瘤新药。前期研究发现，SAL下调入非小细胞肺癌A549细胞的端粒酶活性，缩短端粒长度，而且端粒缩短不依赖于端粒酶活性的丧失。在此基础上，本文针对在研抗肿瘤新药沙尔威辛对端粒DNA的作用及DNA损伤相关分子机制进行了研究，对于进一步了解SAL的抗肿瘤作用和端粒调节机制具有重要的意义。
本研究首先检测了SAL对A549细胞端粒DNA的作用。研究发现50μMSAL作用A549细胞3小时，对细胞生长有轻度抑制，不诱导细胞发生早期凋亡。SAL浓度依赖性的引起DNA发生双链断裂损伤(DNA double-strand break，DSB)，同时诱导A549细胞端粒上产生DNA损伤灶。不同浓度的SAL作用A549细胞3小时，端粒长度逐渐缩短。以上结果表明端粒是SAL的作用位点之一，并且DSB和端粒缩短是SAL作用的早期事件。继而进行了SAL诱导A549细胞发生DSB和端粒损伤的分子机制研究。端粒结合蛋白TRF2(TTAGGG RepeatBinding Factor-2)被认为在维持端粒结构稳定，保护细胞方面有重要作用。研究发现SAL不影响trf2的mRNA水平，降低TRF2蛋白表达水平，但并不通过蛋白酶体途径降解蛋白；同时SAL抑制TRF2蛋白与端粒DNA的结合。TRF2蛋白水平下降和与之结合的端粒比例降低都提示TRF2可能参与SAL引发DSB和破坏端粒的作用。通过构建TRF2真核表达载体，建立稳定表达A549细胞株，TRF2不仅可以降低SAL的细胞毒作用，而且能很大程度上阻碍SAL引起的端粒缩短和DNA双链断裂：采用RNA干扰技术抑制trf2基因表达，加剧了SAL引起的端粒缩短和DNA双链断裂损伤效应。以上结果证实TRF2受抑参与介导了SAL引起的DSB和端粒缩短。观察PIKK(Phosphatidyli nositol3-kinase-relatedkinase)激酶ATM(Ataxia-telangiectasia-mutated kinase)和ATR(ATM-andRad3-related kinase)与SAL诱导的DSB和端粒缩短事件间的联系时发现，ATM/ATR活性抑制剂咖啡因逆转SAL引发的H2AX磷酸化(γ-H2AX)，RNA干扰(RNAi)技术分别抑制两个基因表达也不同程度的减弱γ-H2AX水平，表明ATM和ATR激酶在SAL引发的DNA损伤应答中共同发挥作用。抑制ATM表达对SAL破坏端粒效应无影响，而ATR表达受抑则显著性的减弱SAL对端粒的缩短作用，说明ATR激酶参与了SAL破坏端粒DNA的事件。我们还对TRF2蛋白与ATR激酶之间的相互联系进行了探讨，研究发现TRF2抑制可以活化ATR激酶活性，而ATR表达受抑后可以很大程度的减弱SAL对TRF2蛋白的抑制作用，表明两者相互制约和相互作用参与SAL引起的DNA损伤事件。
综上所述，本研究揭示了SAL对肺癌A549细胞端粒DNA的损伤作用，证实TRF2蛋白受抑参与介导了SAL诱导的端粒DNA损伤和DSB效应，并且发现ATR激酶和TRF2相互制约共同参与SAL的DNA损伤事件。本研究首次报道了DNA损伤药物对端粒结合蛋白TRF2的下调作用，以及对TRF2与端粒DNA结合的抑制作用；并且首次探讨了TRF2与ATR激酶之间的相互联系；在端粒维持机制和DNA损伤修复机制之间建立起有机联系。这些结果丰富和完善了对SAL抗肿瘤作用机制的认识，而且为端粒调节机制提供了新的实验依据，为开发以端粒或TRF2蛋白作为新靶点的抗肿瘤药物提供了新思路。