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骨质疏松症是主要表现为骨量减少、骨微结构破坏，导致骨骼强度和负荷承受能力降低，易于发生脆性骨折的一类全身性骨代谢障碍疾病，也是多种骨破坏性疾病共有的病理损害。骨质疏松发病率高，严重影响患者的生活质量，给社会带来沉重的经济负担。正常骨代谢主要依赖于破骨细胞发挥的骨吸收作用和成骨细胞发挥的成骨作用之间的平衡。任何原因导致这种平衡的破坏都会引起骨代谢性相关疾病。其中，破骨细胞活性和功能的增强在这一过程中发挥着极其重要的作用。 核因子κB受体活化因子配体（RANKL，Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand）对破骨细胞的分化、成熟及功能都发挥着关键性作用。RANKL结合到破骨前体细胞的核因子 κB活化因子受体（RANK）上，启动下游NF-κB，P38，ERK， JNK等信号通路，刺激破骨细胞的分化、成熟及功能。阻断RANKL与RANK的结合，可抑制破骨细胞的分化和成熟。抗RANKL单克隆抗体Denosumab可以特异性地阻断 RANKL 与其受体的结合，有效地的抑制破骨细胞的分化、成熟和功能，对骨质疏松等骨吸收性疾病疗效明显。最近研究表明，在自体蛋白中插入非天然氨基酸（p-硝基苯丙氨酸）可以突破免疫耐受，使机体产生针对自体蛋白高滴度的抗体。 本研究依据小鼠 RANKL 的三维晶体结构信息，利用 p-硝基苯丙氨酸插入这一全新的技术对 RANKL 进行多点定向插入修饰，探讨 p-硝基苯丙氨酸突变的小鼠RANKL蛋白的克隆、原核表达和纯化，构建和筛选针对自体蛋白RANKL的高效疫苗，并探索其对OVX小鼠骨质疏松的治疗作用。 【方法和结果】 ①首先通过RT-PCR克隆了具有活性的小鼠RANKL（mRANKL）的胞外段基因，将编码第 164、234、240、272 位氨基酸的密码子突变成能编码 p-硝基苯丙氨酸（pNO2Phe）的密码子，然后构建了pET28a-pNO2Phe mRANKL重组表达载体并经测序验证构建成功。 ②成功将四个突变的pET28a-pNO2Phe mRANKL重组表达载体与pEVOL质粒共转化至E.coli BL21(DE3)原核表达菌中，用阿拉伯糖和IPTG诱导，成功表达并纯化了目的蛋白（这四个突变的mRANKL蛋白分别简写为F164pNO2Phe、Y234pNO2Phe、Y240pNO2Phe和Y272pNO2Phe）。经SDS-PAGE与Western Blot检测，该蛋白与预测蛋白大小一致；通过高效液相色谱联合质谱检测进一步证实成功插入了 p-硝基苯丙氨酸。 ③以纯化蛋白作为免疫原，采用多位点皮下重复注射的方法免疫小鼠，采用Western Blot和间接ELISA分别检测抗mRANKL抗体滴度和抗血清活性。结果表明，成功制备了小鼠抗mRANKL的抗血清，该抗血清具有较高的活性。Y234pNO2Phe和Y240pNO2Phe 所产生的抗体滴度更高，且能维持 168 天。其抗血清在体外可抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。 ④通过建立小鼠OVX骨质疏松模型，探究了疫苗对小鼠骨质疏松的治疗效果。结果显示，筛选出来的两个疫苗（Y234pNO2Phe和Y240pNO2Phe）对OVX骨质疏松小鼠均具有一定的治疗效果。 【结论】 通过本实验，我们首次克隆并表达了 p-硝基苯丙氨酸突变的小鼠 RANKL （mRANKL）的胞外段，通过高效液相色谱联合质谱检测验证了p-硝基苯丙氨酸的成功插入；并从中筛选出了两个能够诱导小鼠产生高滴度抗 mRANKL 抗体的疫苗（Y234pNO2Phe 和 Y240pNO2Phe），用该疫苗免疫小鼠获得的抗血清在体外可抑制RANKL诱导的破骨细胞形成，而且疫苗对OVX骨质疏松小鼠具有一定的治疗效果。这些结果为进一步探究治疗骨质疏松的新方法打下了一定的基础。