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目的:随着人们生活条件以及生活方式的改变,糖尿病（diabetes mellitus,DM）发病率呈逐年上升趋势,而DM经常伴随多种并发症,严重威胁人类的生活及生存质量,给整个社会和家庭带来沉重的负担。DM人群中冠状动脉疾病（coronary artery disease,CAD）患病率比非DM人群高3-8倍,其中发生致死/非致死性心肌梗死（myocardial infarction,MI）的比例均高于非糖尿病患者,而临床恢复期充血性心力衰竭的发生率亦明显增高,严重影响患者的预后。内质网（endoplasmic reticulum,ER）是存在于许多真核细胞中的重要细胞器,其负责细胞内蛋白质折叠异位、转录后修饰（包括糖基化、二硫键的形成等）、脂质合成以及Ca2+储存等的重要细胞器。在细胞遭受高糖、缺血缺氧、感染、Ca2+稳态失衡或血管紧张素Ⅱ等的刺激下,ER内平衡破坏,导致细胞内未折叠或错误折叠的蛋白质蓄积,即导致内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。早期一定程度的ERS有利于损伤细胞的自我修复,而应激过强或持续存在,则会诱导细胞调亡信号通路的表达,最终可诱发细胞的凋亡。目前已经证明ERS参与胰岛β细胞功能衰竭与此后糖尿病的发生密切相关,相反高血糖同样会引起活性氧产物的过度生成,进而激活ERS途径,参与细胞凋亡进程;近年越来越多的研究证实内质网应激参与了动脉粥样硬化、心肌缺血和心力衰竭的发生发展。随着对ERS认识的不断深入,如何能够有效预防及治疗ERS介导的凋亡成为心血管领域研究的重要内容。C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）的激活是ERS下游介导细胞凋亡的主要途径,CHOP是ERS特异的核转录因子,作为内质网相关促凋亡蛋白,正常生理状态下,其表达水平极低,而在ERS发生时被大量诱导表达,并向细胞核转移,调控其靶基因Ero1α和Bcl-2等的表达,诱导细胞凋亡。既往报道ERS参与心血管疾病的发生及进展过程,然而在高糖合并MI方面ERS的相关分子表达情况及敲低CHOP是否能够起到保护心肌作用尚无报道。本课题拟通过体内及体外实验研究在高糖合并心肌缺血缺氧时ERS相关指标的表达情况,以及观察心脏血流动力学变化、心肌梗死面积、细胞增殖能力、细胞周期和细胞凋亡情况的变化;并通过RNA干扰技术敲低细胞中CHOP的表达研究CHOP在高糖合并心肌缺血缺氧时的作用及机制。研究方法:第一部分:本研究采用SD大鼠进行如下在体动物实验1、采用雄性SD大鼠,随机分为5组:（A）对照组（Control）,（B）糖尿病组（Diabetes）,（C）糖尿病假手术组（Diabetes/sham）,（D）心肌梗死组（Myocardial infarction,MI）,（E）糖尿病合并心肌梗死组（Diabetes/MI）。B、C组和E组首先通过腹腔内注射链脲佐菌素（streptocozin,STZ）制备1型糖尿病（DM）大鼠模型,然后D组和E组采取开胸结扎左冠状动脉前降支的方法制作心肌梗死大鼠模型,C组只穿线不结扎;2、通过记录LAD结扎前后大鼠心电图ST段变化及采用ELISA法检测血液中肌钙蛋白（troponin）及肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量与健康大鼠比较对心肌梗死模型进行鉴定;3、采用压力换能器及生物信号机能实验系统,检测大鼠心率（HR）、左室收缩末压（left ventricular systolic pressure,LVESP）、左室舒张末压（left ventricular diastolic pressure,LVEDP）血流动力学情况;4、采用TTC染色法确定大鼠心肌梗死面积;采用原位末端转移酶标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）染色对心肌细胞凋亡率进行评估;通过苏木素伊红染色（hematoxylin and eosin,HE）评估心肌组织结构和损伤程度;5、通过Western blot法检测大鼠心肌组织内质网应激相关分子（CHOP、GRP78）、细胞凋亡相关分子（Bcl2、Bax）及Ero1α、Ero1β和PDI的表达水平。第二部分:本研究采用体外培养H9c2细胞进行如下实验:1、在体外培养的H9c2细胞中,随机分为6组:A)对照组,正常H9c2细胞系;B)高糖组,对H9c2细胞进行高糖处理;C)缺氧组,对H9c2细胞进行缺氧处理;D)高糖并缺氧组,对H9c2细胞进行高糖处理,于高糖处理结束前24 h进行缺氧处理;E)高糖并缺氧+NC组,H9c2细胞瞬转siRNA NC,转染后24 h后进行高糖并缺氧处理;F)高糖并缺氧+CHOP siRNA组,H9c2细胞瞬转CHOP siRNA,转染后24小时后进行高糖并缺氧处理。2、Real-time PCR及Western blot验证CHOP在mRNA水平和蛋白表达的沉默效率;3、采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;4、采用PI染色流式细胞仪检测细胞周期;5、采用AnnexinV-PI染色流式细胞仪及Hoechst染色检测细胞凋亡;6、通过Western blot法检测各组细胞内质网应激相关分子（CHOP、GRP78）、细胞凋亡相关分子（Bcl2、Bax）及Ero1α、Ero1β和PDI的表达水平。结果:第一部分1、合并糖尿病的心肌梗死大鼠左室舒张末压（LVEDP）显著增加,左室收缩末压（LVESP）和心率显著降低,心肌损伤显著加剧;2、合并糖尿病的心肌梗死大鼠心肌梗死面积显著增加;3、合并糖尿病的心肌梗死大鼠心肌细胞病理变化显著和心肌细胞凋亡指数明显增加;4、合并糖尿病的心肌梗死大鼠内质网应激反应更为强烈,表现为CHOP、GRP78表达进一步增加,并且促进细胞凋亡相关分子Bcl-2的下调和Bax的上调,维持内质网氧化还原状态的Ero1α、Ero1β和PDI表达显著上调。第二部分1、高糖并缺氧处理的H9c2细胞进行CHOP siRNA转染后可以明显降低CHOP的表达水平,敲低CHOP的表达能部分恢复H9c2细胞增殖能力;2、高糖并缺氧处理使细胞被明显阻滞在G1期,转染CHOP si RNA敲低CHOP的表达能够逆转细胞周期阻滞;3、高糖并缺氧处理的H9c2细胞凋亡率明显增加,同时伴随Bax的上调和Bcl-2的下调,敲低CHOP的表达能部分阻断高糖并缺氧处理的促凋亡作用及逆转上述指标的变化;4、在体外实验各组中,高糖和/或缺氧处理明显增加GRP78、CHOP、Ero1α、Ero1β和PDI的水平,敲低CHOP的表达能够部分还原这些关键蛋白的水平。结论:1、糖尿病合并心肌梗死进一步加重心肌损伤,内质网应激反应更加强烈,细胞凋亡相关分子Bcl-2表达明显降低,而促凋亡蛋白Bax则明显升高,内质网氧还原状态更加失衡。2、在高糖并缺氧处理的H9c2细胞进行CHOP siRNA转染可以成功敲低CHOP的基因表达;3、敲低CHOP的基因表达能够有效逆转细胞周期阻滞和高糖并缺氧处理的促凋亡作用,并且促进Bcl-2上调和Bax的下调;4、在高糖并缺氧处理的H9c2细胞敲低CHOP的基因表达可以有效恢复ERS相关蛋白的水平,改善心功能,干扰CHOP通路可以通过调控Bcl-2、Ero1调控细胞的凋亡。