论文部分内容阅读
目的:本研究采用蛇葡萄素(AMP)进行干预,通过定量分析Dermcidin(DCD)基因和相应蛋白的表达水平,Transwell和划痕实验揭示蛇葡萄素抑制大肠癌细胞的迁移以及侵袭运动能力,探讨蛇葡萄素通过DCD对大肠癌迁移和侵袭能力的抑制作用及其作用机制。为寻找抗肿瘤侵袭和转移的药物,特别是高效低毒的抗肿瘤药物,将AMP开发为有效的临床抗肿瘤药物提供实验基础。方法:(一)分析DCD在大肠癌组织及细胞中的表达情况1.采用Q-PCR和western-blot分别检测DCD在5对大肠癌组织和癌旁组织中的表达以及在LoVo、HT-29、SW480、SW620、HCT-116肠癌细胞系和正常肠上皮HIEC细胞系中表达水平。2.通过质粒瞬时转染法分别构建稳定表达pcDNA、WT-DCD、NC-siRNA、DCD-siRNA载体的LoVo细胞,Q-PCR和western-blot检测DCD是否构建成功以及DCD的表达情况;Transwell小室迁移实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验比较各组细胞的迁移以及侵袭运动能力。(二)蛇葡萄素通过DCD抑制大肠癌细胞迁移及侵袭运动1.MTT 法检测不同浓度蛇葡萄素(10、20、50、80、100、200、300、500μmol/L)和 5-FU(0.25、5、10、20、50、100μg/mL)在 24、48、72h 三个不同时间点对 LoVo细胞增殖能力的影响。2.把实验分为 Control、WT-DCD、WT-DCD+5-FU、WT-DCD+AMP 组,除 Control 组采用LoVo细胞外,其余组都使用转染WT-DCD的LoVo细胞;同理,把实验分为NC-siRNA、DCD-siRNA、DCD-siRNA+5-FU、DCD-siRNA+AMP 组,除 NC-siRNA 组采用转染小干扰RNA(siRNA)的LoVo细胞外,其余组均采用转染DCD-siRNA的LoVo细胞。Transwell小室迁移实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验比较各组细胞的迁移以及侵袭运动能力,检测AMP对相应LoVo细胞迁移及侵袭运动能力的影响。Q-PCR和western-blot比较蛇葡萄素通过介导DCD对大肠癌细胞的mRNA和蛋白水平表达的变化。成果:(一)大肠癌组织及大肠癌细胞中DCD的表达1.Q-PCR和western-blot结果表明,DCD在大肠癌组织中mRNA和相关蛋白表达水平均高于癌旁组织(P<0.01);Q-PCR和western-blot实验结果表明DCD在大肠癌细胞SW620、LoVo、HT-29、HCT-116、SW480中的表达均高于正常肠上皮HIEC细胞(P<0.01),与HIEC相比,DCD在高侵袭性大肠癌LoVo细胞中的表达是最为明显的。Q-PCR 和 western-blot 实验结果表明,与 Control 组、pcDNA 组、NC-siRNA组和DCD-siRNA组比较,WT-DCD组细胞中DCD的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。Transwell小室迁移实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果表明,与 Control 组、pcDNA 组、NC-siRNA 组、DCD-siRNA 组相比,WT-DCD 组细胞迁移和侵袭数均显著增加(P<0.01)。(二)蛇葡萄素通过DCD抑制大肠癌细胞迁移及侵袭的实验结果1.Q-PCR和western-blot实验结果显示,与WT-DCD组比较,WT-DCD+5-FU组和WT-DCD+AMP组细胞中DCD的mRNA和相关蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。Transwell小室迁移实验、细胞划痕实验和Transwel l侵袭实验结果表明,与Control组相比,WT-DCD组细胞迁移以及侵袭数均显著增加(P<0.01);与WT-DCD组相比,WT-DCD+5-FU组和WT-DCD+AMP组细胞迁移以及侵袭数均明显减少(P<0.01)。2.Q-PCR 和 western-blot 实验结果显示,与 DCD-siRNA 组比较,DCD-siRNA+5-FU组和DCD-siRNA+AMP组细胞中DCD的mRNA和相关蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。Transwell小室迁移实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果表明,与NC-siRNA组相比,DCD-siRNA组细胞迁移以及侵袭数没有显著性差异(P>0.05);与NC-siRNA组相比,DCD-siRNA+5-FU组和DCD-siRNA+AMP组细胞迁移及侵袭数均显著减少;与DCD-siRNA组相比,DCD-siRNA+5-FU组和DCD-siRNA+AMP组细胞迁移以及侵袭数均明显降低(P<0.01)。结论:(一)DCD在大肠癌患者组织中高表达,很可能是一个潜在的致癌因子;DCD在大肠癌细胞系SW620、LoVo、HT-29、HCT-116、SW480中的表达均高于正常肠细胞HIEC,以高侵袭性大肠癌LoVo细胞的表达最为显著;DCD能促进LoVo细胞的迁移和侵袭运动能力,说明DCD的表达与大肠癌的侵袭和转移有关。(二)通过过表达和敲低DCD在大肠癌细胞中的表达,均证实AMP对过表达及沉默DCD的LoVo细胞的迁移及侵袭运动能力有抑制作用,表明AMP抑制大肠癌细胞迁移及侵袭活力的效应部分由DCD介导。