研究背景周围神经损伤临床常见，具有高致残性，干细胞移植治疗在周围神经损伤治疗中前景广阔。干细胞移植后，需要监测移植的细胞的分布及迁移，传统的方法主要为离体状态下进行组织病理学的分析，MRI具有空间及时间分辨率高，无辐射等优点，可无创、重复性的对移植干细胞进行活体示踪。目前MRI活体示踪干细胞已广泛应用于脑缺血、心肌梗塞、脊髓损伤等多种疾病模型中，但是在周围神经损伤干细胞治疗中尚未见应用。 目的： 1.探讨体外对MSCs进行Gd—DTPA及荧光染料双标记的可行性及安全性。 2.在坐骨神经牵拉伤模型中，探讨MR活体示踪标记MSCs在损伤神经内的分布、迁移、转归情况及示踪的持久性。 3.探讨MSCs移植能否促进周围神经损伤的修复。 材料方法： 1.兔骨髓间充质干细胞的培养与鉴定采用直接贴壁法对兔骨髓MSCs进行分离、纯化和培养，对所获得的细胞进行表面抗原(CD29、CD44、CD166、CD34、CD45)检测进行免疫鉴定。 2.兔MSCs体外双标记及安全性检测以PEI—FluoR为载体将Gd—DTPA标记兔MSCs，使用荧光显微镜、电镜观察细胞标记的可行性，体外MRI成像确定最佳标记浓度。标记后，台盼蓝拒染试验、MTT比色试验、流式细胞术分别检测标记细胞的活力、增殖及调亡情况。体外MRI成像检测最小标记细胞数目及标记的稳定性。 3.周围神经细胞局部移植及MR活体示踪制备兔坐骨牵拉伤模型，将48只兔分为3组，每组16只，分别移植标记、未标记的MSCs、PBS，每组的9只进行1w、2w、3w、4w，6w、8w及10w系列MRI检查，测量牵拉神经损伤段、损伤近段及损伤远段的T1、T2弛豫时间及直径，评价细胞移植后神经损伤的修复，观察后肢的外观、坐骨神经功能评价及组织学检查。每组其它7只移植细胞后，进行1d、3d、7d、10d、14d的系列MRI检查，动态观察移植细胞的分布、存活及迁徙，并行组织学对照检查。 4.统计学分析标记与未标记细胞台盼蓝拒染率、MTT吸光度的比较采用方差分析，组内比较采取LSD检验。各段各组之间的T1弛豫时间、T2弛豫时间以及神经直径比较采用重复测量资料的两因素方差分析模型中多元方差分析。统计学分析使用SPSS15.0，P<0.05认为差异有统计学意义。 结果： 1.MSCs体外双标记及检测MSCs双标记后，细胞内可见罗丹明红色荧光，电镜下胞浆内可见Gd颗粒，T1WI上标记细胞信号增高，标记效率为70％—80％。标记细胞与未标记细胞间台盼蓝拒染率、MTT吸光度值差异无统计学意义(F=0.61-2.17，P>0.05)。标记细胞凋亡指数为0.40％，未标记细胞为0.19％。体外MRI上可检测到最低5×103个标记细胞，并可持续显示第3代标记细胞。 2.MSCs移植后MRI活体示踪细胞移植后，T1WI上标记细胞在牵拉段神经外膜下呈长条状高信号，随时间延长，高信号逐渐减低，神经纤维内信号增高，MRI能够示踪细胞至移植后7天。荧光显微镜证实移植细胞可由神经外膜向神经纤维内部迁移。 3.MSCs移植后MRI测量 损伤近段：PBS组、未标记MSCs组及标记MSCs移植组神经直径各时间点各组间无统计学差异(F=0.509，P=0.873)。标记MSCs组与PBS组T1弛豫时间第2～6周均有统计学差异(P=0.000～0.002)，标记与未标记细胞组T1弛豫时间第2周差异有统计学意义(P=0.003)；未标记细胞组与PBS组于第4～10周差异有统计学意义(P=0.000～0.008)。3组之间T2弛豫时间各时间点彼此之间差异均无统计学意义(F=0.432，P=0.657)。损伤段：标记及未标记组神经直径在第8、10周与PBS组有统计学差异(P=0.001～0.036)，而标记及未标记组之间各时间点差异均无统计学差异(P=0.247～0.935)。标记MSCs组与PBS组T1弛豫时间在术后第1～10周均有统计学差异异(P=0.000～0.010)；标记与未标记细胞组在第1～4周有统计学差异(P=0.000～0.020)；未标记细胞组与PBS组在4～10周有统计学差异(P=0.000～0.015)。标记及未标记MSCs组T2弛豫时间第10周较PBS组有统计学差异(P=0.024，0.035)，而标记及未标记组各时间上均无统计学差异(P=0.565～1.000)。 损伤远段：标记及未标记MSCs组神经直径第8～10周减低，与PBS组有统计学差异(P=0.01～0.04)，而标记及未标记组之间均无统计学差异(P=0.31～0.70)。标记MSCs组与PBS组T1弛豫时间第2～4周有统计学差异(P=0.000～0.030)；标记与未标记细胞组第2～3周有统计学差异(P=0.002～0.034)；未标记细胞组与PBS组于第3～6周有统计学差异(P=0.000～0.033)。各时间点T2弛豫时间3组间无统计学差异(F=1.270，P=0.309)。 4.外观、功能评价及组织学检查 牵拉伤后，移植标记及未标记MSCs组外观、踝下垂、展趾反射、Tarlov评分均较单纯移植PBS组恢复快且优。 病理组织上，第2周时，3组均见神经纤维肿胀、崩解，轴突断裂及脱髓鞘，牵拉近段3组间差异不大，牵拉段及远段，PBS组较标记及未标记MSCs组神经纤维肿胀、崩解，轴突断裂及脱髓鞘明显，同时均出现少量无髓纤维及有髓神经纤维增生。第6、10周时，3组变性及崩解的轴突、髓鞘基本已吸收，再生的神经纤维、雪旺细胞随时间逐渐增多，牵拉段及牵拉远段标记及未标记MSCs组再生神经纤维、雪旺细胞明显多于PBS组，而标记及未标记MSCs组之间差别不大；而牵拉近段3组之间无明显差别。 结论： 1.利用Gd—DTPA及PEI—FluoR可成功对兔骨髓MSCs进行双标记，标记方法简单、安全、有效，MSCs标记后，既可被MRI检测，又可通过荧光显微镜检测。 2.MRI能够活体示踪Gd标记的MSCs在周围神经损伤中的分布及迁移情况，体内示踪时间可持续约7天。 3.MSCs移植能促进周围神经损伤的修复，MRI能反映此修复过程。