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程序性细胞死亡的两种方式凋亡和自噬可以相互促进或抑制，然而，介导这两个细胞死亡过程的分子机制还不是十分清楚。我们以往研究表明冬凌草甲素(oridonin)和肿瘤坏死因子α(TNFα)可诱导小鼠成纤维肉瘤L929细胞发生凋亡。为深入了解冬凌草甲素和TNFα的抗癌机制，我们在本篇论文中详细阐述了调节冬凌草甲素及TNFα诱导L929细胞凋亡和自噬的重要分子机制。
由于大量文献表明活性氧(ROS)可诱导多种癌细胞发生凋亡，因而我们对ROS在冬凌草甲素处理的肿瘤细胞中发挥的作用进行了研究。结果发现冬凌草甲素处理L929细胞后可引起细胞内快速产生大量的ROS，并发生脂质过氧化，导致超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力降低。ROS清除剂NAC的加入完全抑制了冬凌草甲素诱导的细胞凋亡和线粒体膜电位(MMP)的溃散。在进一步检测ROS介导的信号途径时发现，ROS通过促进Bax转位，细胞色素c的释放和ERK的活化诱导凋亡的发生。我们进一步研究了p53在细胞凋亡中的作用，结果表明p53的抑制剂减少了冬凌草甲素诱导的细胞凋亡。同时，抑制了ERK阻止了p53的活化。冬凌草甲素处理L929细胞初期导致了G2/M期细胞比率增加。G2/M周期阻滞的发生伴随着cdc2，cdc25c和cyclinB蛋白表达的下调，而p21和p-cdc2蛋白表达的上调。
进一步实验结果证实冬凌草甲素也诱导L929细胞发生自噬，自噬空泡体的形成、MDC和GFP-LC3荧光颗粒的出现、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率增加和Beclin1蛋白表达的增加证明了自噬的发生。通过自噬的抑制剂3-MA，LC3siRNA或Beclin1siRNA抑制了自噬促进了冬凌草甲素诱导的细胞凋亡。我们进一步研究了p38和NF-κB在冬凌草甲素诱导的细胞凋亡和自噬中的作用，结果发现p38或NF-κB的特异性抑制剂和siRNA促进了凋亡和ROS的产生，但是阻止了自噬。同时，研究发现抑制了自噬减少了p38的活化，抑制了p38阻止了NF-κB的激活。
另外，我们发现钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶calpain在冬凌草甲素诱导的L929细胞凋亡和自噬中发挥重要作用。实验结果显示抑制了calpain增加了冬凌草甲素诱导的细胞色素c的释放和PARP的剪切，表明calpain在冬凌草甲素诱导的细胞凋亡中发挥保护作用。在进一步考察calpain参与的抗凋亡机制时发现，单独加入calpain或蛋白酶体的抑制剂部分阻止了冬凌草甲素诱导的IκBα降解，但同时加入二者的抑制剂几乎完全阻止了IκBα的降解。结果表明calpain和蛋白酶体两个不同的途径共同参与了IκBα的降解。我们进一步研究了calpain对自噬的影响，结果发现calpain抑制剂减少了冬凌草甲素诱导的细胞自噬，Beclin1的蛋白表达和LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转化。
目前，TNFα诱导细胞凋亡和自噬的分子机制还不是十分清楚。在TNFα诱导L929细胞死亡实验中，我们首先精制纯化重组人源TNFα。实验结果表明，TNFα在体外能够明显地抑制L929细胞的增殖。形态学观察和SubG1细胞比率分析证明TNFα诱导L929细胞发生凋亡。进一步实验结果证实TNFα也诱导L929细胞发生自噬，MDC荧光颗粒的出现、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率增加、Beclin1蛋白表达增加、自噬空泡体的形成证明了自噬的发生。进一步实验证明抑制自噬减少了TNFα诱导的细胞凋亡。TNFα处理细胞后时间依赖性的激活了p53，p53的抑制剂明显减少了TNFα诱导的细胞凋亡和自噬，同时减少了AIF，Beclin1和LC3的蛋白表达。另外，TNFα也激活了ERK，JNK和p38，ERK和JNK促进TNFα诱导的凋亡和自噬，而p38抑制凋亡和自噬的发生。进一步研究发现ERK或JNK的抑制剂减少了TNFα诱导的p53的活化。
综上所述，冬凌草甲素通过ROS介导的信号途径诱导L929细胞发生凋亡，冬凌草甲素诱导的自噬通过上调p38和NF-κB的活性抑制凋亡。同时，冬凌草甲素通过降低cdc2和cyclinB的蛋白表达诱导L929细胞G2/M期周期阻滞。Calpain在冬凌草甲素诱导的细胞死亡中，发挥抑制凋亡促进自噬的作用。TNFα诱导的MAPK的活化介导了p53的激活，促进凋亡和自噬两种细胞死亡方式的发生。