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[研究背景]肝细胞性肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是一种对人类身心健康有着严重危害的疾病,近几年来,其发病率和死亡率均居高不下。与其他癌症相似之处在于,多种复杂的发病机制参与了肝癌的发生与发展。微小RNA(miRNAs,miRNA)也是其中一员,在癌症中起着原癌基因或异癌基因的作用。miRNA,又称微小RNA,它是由长度约18-24个核苷酸的内源性基因编码组成,是一种非编码单链RNA分子,具有转录后调控功能,可以调节细胞的生长、分化、增殖及凋亡等多种生命活动。目前有文献报道,某些miRNA在多种肿瘤中的表达水平异常,例如肝癌、宫颈癌、胃癌等。此外,有几种miRNA可以调控肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其中包括miR-143、-203和-221等等。miRNA在癌症中可以起着原癌抑或抑癌基因的角色,而对于它的抗癌效果,人们试图将其转运至肿瘤中,以达到治疗的目的。多篇文献已有报道,microRNA-100(miR-100)在多种癌细胞中表达水平异常,例如miR-100能抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭与增殖。而目前的困难在于转运载体体系的投放问题,例如安全性和靶向性。多项研究均表明,纳米颗粒可以作为将miRNA转移至肿瘤的高效介质的优良选择。磁性四氧化三铁纳米颗粒被广泛应用于癌症的临床诊断和治疗以及基因转移。它们有许多用途,例如检测不同的疾病,包括退行性疾病和炎症,以及肿瘤的早期诊断。磁性纳米颗粒的外涂层可以与各种配体(如siRNA或miRNA)结合,从而形成一个靶向载体系统。在本研究中,通过体内实验观察了用这种磁性纳米颗粒转运miR-100的载体体系在肝癌细胞株HepG2和BEL-7404细胞中的转运效率和治疗效果。我们的结果表明Fe3O4纳米载体能有效地将miR-100-3p转运至肝癌细胞中,从而降低肝癌细胞的恶性生物学行为。[研究方法]1.检测Fe3O4/PEI的粒径与电势。2.用qRT-PCR检测人正常肝细胞(HL-02)和几种HCC细胞株(HepG2,SMMC-7721,QGY-7701,BEL-7404 和 Hep3B)来检测 miR-100-3p 的表达,选出两种 miR-100-3p表达相对较低的肝癌细胞(HepG2,BEL-7404)。3.用PI和DAPI染色检测载体材料的毒性。4.用普鲁士染色检测肝癌细胞摄取载体材料的能力。5.用磁靶向实验检测载体材料的靶向能力。6.确定miR-100-3p与Fe3O4结合的质量比,并检测各质量比时两者的粒径和电势。7.将Fe3O4与miR-100-3p共孵育,分别转运至两种肝癌细胞中,检测成功转运后的肝癌细胞的生物学功能。(1)Transwell/Matrigel法检测HepG2和BEL-7404细胞株迁移和侵袭的能力。(2)划痕实验检测HepG2和BEL-7404细胞株的伤口愈合能力。(3)增殖实验检测HepG2和BEL-7404细胞株的增殖能力。(4)粘附实验检测HepG2和BEL-7404细胞株的黏附能力。[研究结果]1.TEM结果显示,Fe3O4/PEI颗粒分布均匀,水溶性好。粒径与电势结果显示,Fe3O4/PEI的水动力尺寸处于纳米级别,而Zeta显示正电荷。2.miR-100-3p在几种肝癌细胞株中水平普遍降低,尤其是在HepG2和BEL-7404细胞株(p<0.01)。3.PI染色结果显示,与不同浓度的材料一起孵育过后的细胞所发出的红色荧光均很少,证明这种材料对两种细胞的毒性均很小,生物亲和力比较好。4.普鲁士蓝染色结果显示,与不同浓度的材料一起孵育过后的细胞被复染成红色,而细胞质上显示有蓝色颗粒,证明这种纳米颗粒可以吸附到细胞质中。5.磁靶向实验发现外加磁场的一侧发生材料聚集。PI染色也可以看出,材料聚集的一侧死细胞很少,对细胞几乎没有毒性。6.将miR-100-3p和Fe3O4按不同的质量比室温孵育,然后进行结合,用PCR检测miR-100-3p的表达,最终决定按1:8的质量比作为两者的结合比例进行后续实验。7.Fe3O4/miR-100-3p对HepG2和BEL-7404肝癌细胞株生物学行为的影响:(1)对肝癌细胞侵袭能力和迁移能力的影响:Transwell小室检测结果显示,在Fe3O4将miR-100-3p转运至HepG2和BEL-7404两种肝癌细胞株中之后,细胞的迁移和侵袭能力明显减弱。(2)对肝癌细胞迁移能力和伤口愈合能力的影响:划痕结果显示,在Fe3O4将miR-100-3p转运至HepG2和BEL-7404两种肝癌细胞株中之后,细胞的迁移能力减弱。(3)对肝癌细胞增殖能力的影响:细胞增殖实验结果显示,在Fe3O4将miR-100-3p转运至HepG2和BEL-7404两种肝癌细胞株中之后,细胞的增殖能力稍减弱。(4)对肝癌细胞黏附能力的影响:粘附实验结果显示,在Fe3O4将miR-100-3p转运至两种肝癌细胞株中之后,细胞的粘附能力稍降低。[结论]1.利用物理方法(高温水热法),成功构建了 Fe3O4/PEI磁性纳米载体。2.Fe3O4磁性纳米颗粒的生物相容性较好,对肝癌细胞的毒性较小,且具有良好靶向性。3.Fe3O4磁性纳米载体将miR-100-3p成功转染进肝癌细胞后,抑制了 HepG2和BEL-7404细胞的恶性生物学行为。