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2,3-丁二醇（2,3-butanediol，2,3-BD）是一种非常重要的平台化合物和液体燃料，其被广泛应用于化工、燃料、食品以及航空航天等多个领域。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）以其广泛的底物利用能力、较高的生产效率而被认为是最具有工业化潜力的2,3-BD生产菌种之一。但是该菌株在进行2,3-BD发酵时会产生多种代谢副产物，如：乙酸、乳酸和乙醇等物质，这些副产物在一定程度上降低了2,3-BD的产量，并且也影响了2,3-BD的后提取与纯化，增加了下游处理的难度和生产成本。目前关于K. pneumoniae代谢改造还鲜有报道，因此研究调控2,3-BD及主要副产物的代谢途径极为重要，将为提高2,3-BD的产量提供重要的理论支持。本论文主要包括以下几个方面的工作：（1）在K. pneumoniae菌株中成功实现了乙酰乳酸脱羧酶、乙酰乳酸合成酶和乙偶姻还原酶单独、两两和三者同时过表达。基因工程菌发酵性能实验表明，同时过表达乙酰乳酸合成酶和乙偶姻还原酶的工程菌KG-rs能够较显著提高2,3-BD的产量。KG-rs菌株胞内较高的酶活和NADH供应可能是菌株2,3-BD产量提高的原因。同时对菌株利用5种碳源发酵产2,3-BD进行了比较，除乳糖外，KG-rs在葡萄糖、蔗糖、果糖和半乳糖为唯一碳源的培养基上都表现出来较高的2,3-BD产量和转化效率。（2）分别构建了乳酸脱氢酶基因缺失、乙醇脱氢酶基因缺失和磷酸转乙酰基酶基因缺失的基因工程菌株K. pneumoniae△ldhA、△adhE和△pta。发酵数据显示△adhE和△pta2,3-BD产量分别提高了33.65%和19.58%；△ldhA生长速度加快，但是2,3-BD产量提高幅度不大。从菌株生长性能、酶活性、胞内NADH和NAD+浓度和代谢流等参数解释了△ldhA、△adhE和△pta发酵性能差异的原因。（3）△ldhA、△adhE和△pta在以葡萄糖、果糖和半乳糖为唯一碳源的培养基发酵时，2,3-BD的产量和生产效率都有所提高。但是，它们在以乳糖为唯一碳源的培养基上发酵时，2,3-BD的产量和乳糖消耗速度都降低了。酶活检测数据表明，基因缺失菌株中乳糖酶和乳糖通透酶的酶活降低了，这部分解释了为什么△ldhA、△adhE和△pta利用乳糖发酵效率降低。