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黏膜免疫系统是构成动物免疫系统的重要组成。七鳃鳗生活在水体中,其皮肤和鳃直接与水环境接触,因此鳃黏膜组织是七鳃鳗抵御感染的一道重要防线。为探索日本七鳃鳗鳃(Lampetra japonicus)黏膜免疫反应的遗传基础,本文利用第二代高通量转录组测序技术对日本七鳃鳗的鳃组织进行了高通量测序,通过生物信息学方法分析了被混合菌免疫刺激后,日本七鳃鳗与免疫相关分子的差异表达情况。结果表明:1.混合菌刺激后,鳃黏膜中与生理过程相关的一些分子相对表达量下调。这些分子包括:肌球蛋白轻链家族(myosin light chain 3,MYL)、肌球蛋白重链家族(MYH)、钙肌蛋白T家族(Troponin T,TNNT)等,说明感染病原菌后生物体呈现生理活性减低现象。2.与高等脊椎动物TCR信号通路相关信号分子的相对表达量上调。这些分子包括:有丝分裂原蛋白激酶p38(mitogen activated protein kinases p38,p38MAPK)、NCK衔接因子蛋白1(NCK Adaptor Protein 1,NCK)以及酪氨酸蛋白激酶Lck、Fyn和Tec,说明七鳃鳗鳃黏膜免疫系统的免疫应答反应存在与高等脊椎动物TCR信号通路相保守的分子基础。3.在七鳃鳗鳃黏膜系统中类T细胞表达的VLRA和VLRC受体数量和种类占优势,其中胚系VLRC的表达量有明显上调趋势,而具有功能性的VLRC也发生了从无到重排的变化,说明七鳃鳗鳃黏膜免疫系统主要以VLRA和VLRC两种了类T细胞受体的免疫应答反应为主。为深入研究VLRC在七鳃鳗免疫应答过程中的作用,本文制备了该分子的兔源多克隆抗体,为未来对其功能的深入研究奠定了基础。通过对多个VLRC蛋白序列进行同源比对,发现保守性较高的结构域为LRRCT(leucine-rich repeat C terminal)和LRRNT(leucine-rich repeat N terminal),其序列一致性分别为85%和63%。而通过在线网站预测VLRC分子的抗原表位,发现在所检测到的13个抗原表位中,位于LRRNT结构域第38-51个氨基酸处的肽段抗原性比较好,确定以LRRNT结构域为抗原肽段。接着对LRRNT序列构建表达载体进行诱导表达,发现在条件为37℃,IPTG浓度为1mmol/m L时诱导表达效果最好。对诱导后的蛋白进行纯化,将纯化后的可溶性蛋白LRRNT与佐剂混合制成抗原,对新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)进行皮下多点免疫注射,经过4次加强免疫,最终获得效价高达1:128000的多克隆抗体。通过免疫印迹法对纯化后的抗体进行检测,发现所制备的多抗不仅可以识别重组蛋白而且可以在鳃组织所制备的样本中检测到天然VLRC受体蛋白。以上结果说明,本文所制备的VLRC多克隆抗体特异性较高,可以为后续的VLRC功能研究的顺利开展提供保障。