【背景】肝细胞肝癌的发生率近年持续增加,目前已成为全球肿瘤相关性死亡的第二大原因,全球每年约有80万人死于肝细胞肝癌。我国是世界肝癌发病率最高和死亡人数最多的国家。目前肝癌的治疗分为根治性治疗、姑息性治疗和对症治疗。虽然早期根治性手术的五年生存率能达到75%,但是多数肝癌患者发现较晚,不能进行根治性手术,导致肝癌患者五年生存率很低。常用的肝癌诊断标记物的敏感度和特异度并不十分理想。因此,目前临床急需寻找到特异性和敏感性更高的诊断标志物,特别是早期肝癌的分子标记物。另外,在肝癌的分子靶向治疗方面,目前包括较为有效的索拉菲尼在内的所有靶向药物都只对部分患者有效,且疗效有限。因此,目前肝癌的临床早期诊断及治疗仍面临诸多问题。深入探讨肝癌发生发展的调控机制,寻找到早期肝癌的分子标记物及生物靶向治疗的新靶点,对于我国肝癌的防治具有重大意义。昼夜节律调控人体的各种代谢和生理功能。目前发现,昼夜节律是由核心生物节律基因通过转录、翻译后形成负反馈环路而产生的。到目前为止已经在人类染色体定位并克隆出10种核心生物节律基因(NPAS2、CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、TIM和CKI)。这些核心生物节律基因直接参与调控包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞代谢和细胞免疫在内众多细胞的生命活动。越来越多的证据表明节律基因的紊乱与肿瘤的发生和进展直接相关。NPAS2是核心生物节律基因中的一个重要成员。它参与调控包括DNA损伤修复、炎症反应、激素分泌、细胞代谢等诸多生理活动。NPAS2的异常与包括高血压、胎儿肝脏代谢、非酒精性脂肪性肝病、冬季抑郁症、慢性疲劳综合征及肿瘤在内的多种疾病密切相关。我们前期预实验结果提示NPAS2分子在肝癌组织中表达显著升高。目前对NPAS2分子的认识尚不全面,NPAS2在肝癌中的作用还未有报道。因此,深入探讨NPAS2可能的促肝癌生长的作用和分子机制对于全面了解肝癌进展的病理过程具有重要意义。【目的】1.明确节律分子NPAS2在肝癌中的表达情况,分析NPAS2表达强度对于患者预后的影响。2.分析NPAS2分子在肝癌细胞中的生物学作用。3.阐明NPAS2分子在肝癌细胞中发挥其生物学功能的具体分子机制。【方法】1.以收集的肝癌组织样本及肝癌公共数据库为研究对象,利用q RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学染色检测NPAS2在肝癌中的表达情况,同时与患者预后及临床参数进行分析。2.利用MTS、克隆形成、Ed U、流式细胞术和Western Blot实验,分析NPAS2对肝癌细胞生长的作用。3.利用裸鼠皮下成瘤实验,在体内分析NPAS2对肿瘤生长的影响。4.利用q RT-PCR、Western Blot、IHC、双荧光素酶报告基因、Chip-PCR和Co-IP实验,分析NPAS2对肝癌细胞生长作用的分子机制。5.利用BMAL1干涉片段及细胞生长表型实验分析BMAL1是否参与了NPAS2对肝癌细胞生长作用的调控。【结果】1.NPAS2在肝癌组织中的表达是显著高于癌旁组织,NPAS2表达高的肝癌患者总生存期及无复发生存期均较低表达NPAS2的患者短。NPAS2表达水平与肝癌患者AFP水平和肿瘤大小呈正相关。2.通过体内、外实验证实了NPAS2分子促进肝癌细胞的增殖,抑制肝癌细胞凋亡,最终效应是促进肝癌细胞存活,促进肿瘤生长。3.肝癌细胞中NPAS2直接转录上调CDC25A的表达,进而通过CDC25A激活CDK2/4/6,促进细胞G1期到S期的转换;通过CDC25A介导去磷酸化p-Bcl-2(Thr69),抑制肝癌细胞凋亡。4.节律分子BMAL1协同NPAS2参与NPAS2促进肝癌细胞生长的作用,NPAS2/BMAL1异源二聚体在肝癌的进展中发挥着重要作用。【结论】我们通过临床组织样本的检测、生物信息学的分析、体外细胞实验和体内动物实验,首次发现肝癌组织中NPAS2表达升高,同时其表达水平与患者预后呈负相关性。BMAL1协同NPAS2通过CDC25A介导促进肝癌细胞增殖、抑制细胞凋亡,最终加速肝癌细胞生长,促进肿瘤进展。因此,NPAS2有可能成为未来肝癌预后的分子标记物及生物靶向治疗的新靶点。