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GaHD1基因为HD-ZIP IV转录因子家族成员,主要起信号转导作用,其最终的信号受体为纤维发育相关功能基因。已有的相关报道发现GaHD1是控制茸毛和纤维起始的关键调控基因,并受赤霉素(GA3)诱导(本项目研究基础)。为了探索GaHD1的上游调控基因,同时验证GaHD1是否为正反馈调节基因,我们运用生物信息学方法,提取GaHD1上游启动子调控区域,分析其中是否含有HD1基因结合的顺式作用元件L1box,并预测和验证了直接调控GaHD1的上游基因。主要结果如下:1.首先克隆得到了GaHD1基因启动子,生物信息学分析启动子区潜在的顺式作用元件,根据L1box存在的位置,克隆了不同长度的4条启动子片段(HD1-Pro-R1、HD1-Pro-R2、HD1-Pro-Intron、HD1-Pro-full Length),分别构建了这4种启动子片段与GUS报告基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。GUS活性分析表明,4个启动子片段驱动GUS的表达情况有差异,其中,HD1-Pro-R1染色很淡,茎秆、叶片茸毛均无染色。HD1-Pro-R2颜色较深,叶片、茎秆茸毛均被染色,这可能是由于R2片段相较R1多了L1box,说明L1box是在茸毛中表达的非常重要的元件。HD1-Pro-Intron片段包括5’-UTR区域且只在叶片边缘有GUS染色,说明5’-UTR区有在叶片边缘特异性表达元件。HD1-Pro-full Length GUS活性极高,在几乎所有区域均表达。说明UTR部分的内含子元件可以使该启动子不仅可在叶片边缘特异性表达,还具有启动子增强作用。随后我们对转基因拟南芥叶片进行GUS活力检测,结果显示:HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron GUS活力水平较低,而HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length GUS活力水平很高,与染色结果一致,且达到显著水平。另外,我们将转HD1-Pro-full Length启动子的转基因拟南芥植株做石蜡切片,发现GUS活性在其茎和叶片表皮细胞中高亮表达。同时,我们用5μM GA3处理转基因拟南芥植株,结果显示,GA3处理后,HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron GUS染色及其活力水平相较于处理前均几乎无变化,而HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length因为含L1box,GUS活性均有所增加。这说明GA3能够诱导某些基因或转录因子起到结合L1box调控HD1基因表达的作用。2.体外验证GaHD1的上游调控转录因子,克隆了已知的与棉纤维发育相关的转录调节因子(GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9),分别将其与PCY载体融合,转化拟南芥原生质体,其中GaPDF2和GaMML9先前未研究过,我们对其进行了亚细胞定位的研究,结果发现这两个转录调节因子都在细胞核中表达。3.为了明确GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9这四个转录调节因子与GaHD1启动子的关系,本研究采用酵母单杂交方法。结果发现,GaHD1启动子能够与GaHD1,GaPDF2,GaMML9调节因子结合,不能与GaMML7,GaHOX3结合,说明GaHD1可以与自身基因结合;GaPDF2,GaMML9是HD1上游转录调节因子。4.利用烟草瞬时转化实验体内验证GaHD1的上游调控转录因子,结果发现,启动子HD1-Pro-R1和HD1-Pro-Intron,分别共转化GaHD1,GaHOX3,GaPDF2,GaMML9调节因子后GUS活力水平和单一启动子相比无明显变化;启动子HD1-Pro-R2和HD1-Pro-full Length含有L1box,分别共转化GaHOX3后GUS活力无显著变化,而分别共转化GaHD1,GaPDF2或GaMML9后烟草的GUS活力水平比单一启动子明显增强,说明GaHD1,GaPDF2,GaMML9能够结合到GaHD1启动子上并增强GaHD1基因表达,该试验进一步确认了HD1上游的调控因子。