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TTV（Torque teno virus）属于环病毒科指环病毒属成员,为单股、环状、负链的DNA病毒,正20面体对称结构,无囊膜。人源TTV基因组大小约为3900bp,猪源TTV约2700bp。到目前为止,尚未发现猪源TTV与任何一种猪病有必然联系,但是与一些猪病的发生有一定的相关性,如断奶猪多系统衰竭综合症、猪皮炎肾炎综合症等,因此,研究猪源TTV对于预防其潜在的致病性有重要意义。1、由于还没有找到适合在体外培养TTV的细胞系,其基因组结构及复制转录机制尚不清楚。本研究利用本实验室构建的含有TTV2基因组三种不同拷贝数的质粒pSK+1TTV2（含有1个TTV2基因组拷贝的pSK载体）、pSK+1.3TTV2（含有1.3个TTV2基因组拷贝的pSK载体）、pSK+2TTV2（含有2个TTV2基因组拷贝的pSK载体）,将其转染至张氏肝细胞,48小时后,提取总的RNA,用DpnI消化其中可能存在的DNA,然后利用预测的阅读框ORF1、ORF2、ORF3的扩增引物,确证其中的DNA已经消除干净。RNA经反转录后,用这三对引物扩增目的基因片段,经克隆和测序,结果发现:ORF1确实发生了转录,但转录产物并非ORF1全长序列,而是在TTV2基因组的1020nt至1706nt处发生了687个碱基的剪切,剪接后的mRNA编码区序列全长为1188bp,这是之前没有预测到的;由于ORF2被包含在ORF3之中,因此,我们尽管扩增出了条带,但仍不能确定其是否发生了转录,然而,通过序列比对发现,这个可能转录的阅读框并没有发生剪切;ORF3确实存在,而且通过序列比对发现,ORF3确实像被预测的那样是由两个基因片段剪接而来的,这两个基因片段分别位于TTV2基因组的393nt-595nt和1934nt-2330nt上,ORF3的全长序列大小为600bp;ORF3在被预测的剪接方式的基础上又进一步发生了两种形式的剪接,一种剪接发生在TTV2基因组的2048nt-2118nt处,剪切了71bp,剪接后的mRNA编码区序列全长为529bp,另一种剪接发生在TTV2基因组的2048nt-2138nt处,剪切了91bp,剪接后的mRNA编码区序列全长为509bp,从而产生了两个新的阅读框,我们将前一种剪接方式产生的阅读框称为ORF4,将后一种剪接方式产生的阅读框称为ORF5。进一步分析发现,ORF3、ORF4、ORF5的剪接方式皆完全符合GT-AG规则,而ORF1的剪接并没有按照这一规则进行。2、分别在TTV1和TTV2的UTR区域找出一段既高度保守又高度特异的核苷酸序列,大小分别为137bp和139bp,将两片段核苷酸序列克隆至pMD18-T载体上,分别转化至DH5α感受态细胞,扩增后提取质粒,制备阳性标准品。分别在TTV1和TTV2的上述区域设计引物和TaqMan探针。经优化反应条件,绘制标准曲线,分别建立了针对TTV1和TTV2的荧光定量PCR检测方法。TTV1标准曲线的相关系数为0.984,TTV2标准曲线的相关系数为0.994。此两种方法的最低检出量均可达10copies/μL,除猪源TTV外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪流感病毒检测结果均为阴性,批内和批间重复性试验变异系数均小于3%。利用建立起来的两种荧光定量PCR检测方法检测采集自广西和内蒙古的44份病料,结果显示,TTV1的阳性率为47.73%,TTV2阳性率为70.45%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率为31.82%。病料中TTV1 DNA含量一般在105 copies/g-108 copies/g之间,TTV2 DNA含量一般在106 copies/g-107 copies/g之间。猪源TTV检测方法的建立为该病毒的流行病学调查和定量提供了有效的手段。3、本研究将ORF1的表位富集区（ORF1a）和ORF2全长分别克隆到pColdTMI DNA载体上,重组质粒在BL21（DE3）pLysS细胞中高效表达。其中,ORF1a表达出包涵体形式的重组蛋白,菌体经超声波破碎和包涵体洗涤液纯化后获得了高纯度的纯化蛋白。而ORF2表达的可溶性重组蛋白利用镍离子亲和柱纯化后获得同样高纯度的纯化蛋白。将上述两种纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备出相应的多克隆抗体,多克隆抗体经ELISA检测效价可达1:10000,为进一步研究ORF1、ORF2的亚细胞定位和功能、感染性克隆的构建、病毒的分离等提供了良好的工具。