【摘 要】
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该研究以本实验室构建的pDLV和pLN质粒为模板,采用PCR的方法分别扩增出EIAV DLV疫苗株和LN强毒株的env和gag基因,测序结果可知DLV Env蛋白比LN Env蛋白少2个N-L连接糖基化位
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该研究以本实验室构建的pDLV和pLN质粒为模板,采用PCR的方法分别扩增出EIAV DLV疫苗株和LN强毒株的env和gag基因,测序结果可知DLV Env蛋白比LN Env蛋白少2个N-L连接糖基化位点,均位于gp90内.利用B<,AC>-To-B<,AC>杆状病毒表达系统将序列正确的目的基因片段转移至含杆状病毒基因组的大质粒Bacmid上,然后转染Sf9昆虫细胞,获得的重组病毒扩增后,再大量感染Sf9昆虫细胞,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组杆状病毒正确地表达了目的蛋白.根据上述EIAV DLV和LN的env和gag基因的测序结果设计突变引物,采用PCR搭接突变的方法去除痘苗病毒早期转录终止子TTTTTNT序列,将突变后的EIAV DLV和LN的menv和mgag基因克隆到pSC65痘苗病毒表达载体pE/L启动子的下游,得到的重组质粒转染已预先感染了痘苗病毒天坛株的TK<->143细胞,经Budr加压和蓝白斑筛选挑选和纯化重组病毒,抗体染色和Westerm blot鉴定结果表明,重组痘苗病毒正确地表达了目的蛋白.
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