松材线虫病是松树的一种毁灭性病害,培育出高抗的马尾松苗在林业建设上具有积极的意义。广东省马尾松的种植,主要以信宜市的马尾松高脂松为主,该马尾松苗被认为是抗性松苗已被大面积种植,但在广东本地未见对其抗性评价的报道,因此,急需建立一套马尾松苗抗松材线虫病的抗性评价技术。本研究选取广东省林业科学研究院苗圃的信宜马尾松生产用苗,采用“截枝套管法”对接种过和未接种过松材线虫的三年生马尾松苗分别进行人工接种松材线虫,通过观察其症状和检测松木内所含线虫数量,评价其对松材线虫病的抗性。因抗性评价中存在大量的样本需要分离松材线虫,传统松材线虫的分离方法只能分离具有活性的松材线虫,本研究针对抗性评价中大量样本不能及时分离的问题,建立了马尾松内失活线虫的分离技术,并对此技术的应用进行了探讨,取得了如下创新性成果:1.发现了三年生马尾松苗单株发病症状特点:(1)侧枝、顶部或主枝开始发病,随即病情蔓延至全株;(2)有些症状只出现在植株的顶部、侧枝或主枝上,发病部位针叶黄化或变褐,病情无扩展;(3)整株针叶先褪绿,后逐渐枯死。2.优化了三年生马尾松苗对松材线虫病的抗性评价技术。接种122d后,将三年生马尾松苗的抗性分为5个等级,每个等级间症状差异显著。0级,高抗,马尾松苗无发病症状;1级,中抗,马尾松苗1/4以下针叶变黄,接种后期(118d左右)开始发病,再过2-4d可达到1级症状;2级,低抗,马尾松苗2/4-3/4针叶变黄、1/4以下针叶变红,中后期(100d左右)开始发病,再过6-8d可达到2级症状;3级,感病,马尾松苗3/4左右针叶变红,接种20d即可发病,再过14d可达到3级症状;4级,高感,马尾松苗全株枯死,接种前期(8-20d)开始发病,再过5-30d即死亡。在此基础上同时对不同抗性等级松苗内线虫的平均含量进行测定,研究结果表明,随着三年生马尾松苗发病症状的不断扩展,线虫含量逐渐增多;植株完全枯死后,枯死马尾松内松材线虫因缺少水分而部分死去,线虫含量随之降低。3.三年生马尾松苗抗性存在明显分化。统计接种122d时马尾松苗等级数的研究结果表明,初次接种的13棵三年生马尾松苗的0级、1级、2级、3级和4级发病等级的松苗数分别为5、1、2、2和3棵,其发病率和死亡率分别为61.54%和30.77%;第二次接种的6棵三年生马尾松苗的0级、1级、2级、3级和4级发病等级的松苗数分别为4、1、0、0和1棵,其发病率和死亡率分别为33.33%和16.67%。二次接种较初次接种的马尾松苗对松材线虫的抗性强,表明马尾松苗期种植前的抗性筛选很有必要。4.建立了马尾松病木内失活线虫的分离技术,成功将失活松材线虫分离出来,并且酶解出来的松材线虫形态完整,可用于松材线虫计数和PCR鉴定。5.优化了马尾松病木内失活线虫的分离参数。确定了冰冻、常温和低温材料的最适酶解浓度分别为0.005/0.001mg/μL、0.01/0.002mg/μL和0.005/0.001mg/μL,同时冰冻、常温和低温材料的最适酶解时间同为6h。6.确定了贝尔曼漏斗法和酶解法分离出的线虫数量呈正相关。冰冻、常温和低温条件下的材料经贝尔曼漏斗法和酶解法所分离出线虫数量的一元线性回归方程分别为Y=1.1748X+10.226,R2=0.90742;Y=1.2687X-66.698,R2=0.86056和Y=1.1606X-69.24,R2=0.89228,R2均介于0和1之间,表明贝尔曼漏斗法和酶解法分离出的线虫数量具有较好的正相关性。