论文部分内容阅读
目的通过藻酸钙复合自体软骨细胞移植修复兔膝关节关节软骨缺损,观察缺损近期修复情况。方法1.取34-37周新西兰大白兔左膝关节软骨,酶消化后得到高纯度软骨细胞体外单层培养。2.将体外培养软骨细胞行台盼蓝活性检测,传代扩增,并对其形态学进行观察,绘制细胞生长曲线。在第三代软骨细胞爬片后,行Mallory染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化以鉴定软骨细胞；3.分析纯低粘度藻酸钠(sigama公司)溶于NaCl的溶液中制备藻酸钠凝胶,并滴入CaCl2溶液中交联形成空白藻酸钙凝珠,行大体观察及HE染色观察。4.藻酸钠凝胶与消化后第三代软骨细胞混合后制成细胞凝胶悬液滴入CaCl2溶液中交联形成藻酸钙-软骨细胞凝珠后,置于高糖DMEM完全培养液中行三维培养4周。5.将培养4周后的藻酸钙-软骨细胞凝珠行大体形态观察,倒置相差显微镜下观察,苏木素-伊红(HE)染色,及Ⅱ型胶原免疫组化染色观察。6.制作兔膝关节软骨缺损模型,分为3组,实验组植入自体软骨细胞—载体复合物,实验对照组植入单一培养基浸泡的藻酸钙凝珠,空白对照组不植入任何材料,单一缺损模型。各组术后分别于第8周、第12周取材行大体观察、HE染色、和Ⅱ型胶原免疫组化染色观察,并用Wakitani法进行组织学评分。结果1.(1)前三代软骨细胞生长增殖迅速,形态呈多边形,短梭形,三角形,融合时呈铺路石状卵圆形,相反四代以后的软骨细胞形态不规则,呈长梭形,第六代软骨细胞类似成纤维细胞。(2)第三代软骨细胞Mallory、甲苯胺兰异染反应及Ⅱ型胶原免疫组化强阳性。2.(1)空白藻酸钙载体及藻酸钙-软骨细胞凝珠HE染色可见凝珠内部呈丝网状,空隙比较均匀,具有良好的空间结构,细胞在凝珠孔隙内呈圆形或梭形均匀分布,生长良好；(2)藻酸钙-软骨细胞复合物Ⅱ型胶原免疫组化染色可见细胞胞浆及细胞周围大量Ⅱ型胶原表达。3.动物模型术后第8、12周时,实验组缺损为透明软骨样修复,实验对照组为纤维软骨样修复,空白对照组为纤维性修复。在同一时间点,实验组修复效果优于实验对照组。其中Wakitani组织学评分结果显示实验组与实验对照组有显著差异,且两组均优于空白对照组,同时各组第12周评分结果均优于第8周。结论1第三代自体软骨细胞可以作为软骨组织工程移植用的种子细胞,软骨细胞在藻酸钙载体内的三维培养有助于维持软骨细胞形态及表型。2藻酸钙-自体软骨细胞复合物对关节软骨缺损有修复作用,修复效果优于支架对照组,差异有统计学意义,且两组结果均优于空白对照组。