EBR对玉米光合作用暗反应关键酶及其基因表达的影响

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玉米(Z.Mays)一直是全球最重要的农作物之一,人口增长使得人们对作为食物、饲料及其他工业原料的玉米的需求继续增加。尽管全球需求不断增加,但由于技术水平低,易受到环境胁迫影响等因素,玉米的产量仍旧较低。由于农作物的产量直接取决于光合作用的水平,因此利用现有技术提高玉米光合作用的能力是增加玉米产量的有效途径。研究发现,新型激素——油菜素内酯能够通过影响叶绿素含量、光合作用相关酶活性及其基因的表达从而提高作物的光合作用能力,但其对玉米光合作用的影响研究大多停留于生理水平,且鲜有对光合作用基因影响的报道。本研究以玉米自交系“Mo17”为材料,研究24-表油菜素内酯(24-Epibrassinolide,EBR)对玉米种子萌发、玉米叶片叶绿素含量、玉米叶片可溶性糖含量的影响;研究了EBR对RCA、FBPase等6种光合作用暗反应相关酶活性和含量的影响;研究了EBR在玉米幼苗、离体叶片和原生质体三个层次对编码光合作用暗反应相关酶的8个基因表达量的影响;克隆了Zmrcaβ基因、Zm PEP基因和Zm FBPc基因的启动子,对其进行生物信息学分析;构建了Zmrcaβ基因和Zm PEP基因启动子的瞬时表达载体,用于后续实验。具体结果如下:1.种子萌发实验结果表明28℃是玉米种子发芽的最适温度,在此温度下经0.1μmol/L EBR浸种24 h处理的种子发芽率比对照提高了35.29%,差异达到了极显著水平(p<0.01);EBR处理玉米幼苗以后,当处理浓度为0.2μmol/L、处理时间为24 h时,叶绿素含量增加最多,相比于对照组提高了9.65%。可溶性糖含量则在EBR浓度为0.5μmol/L处理24 h后比对照组提高了36.92%,差异达到了极显著水平(p<0.01);EBR处理离体玉米叶片以后,当处理浓度为0.1μmol/L、处理时间为12h时,叶绿素含量比对照组提高了9.92%,而EBR对离体叶片的可溶性糖含量几乎没有影响。2.用ELISA试剂盒测定经过EBR处理的叶片中的相关酶含量及活性,结果显示经过不同浓度的激素处理24 h后,PEPC、RCA等5种酶活性都能极显著提高(p<0.01),而FBPase活性与对照组相比却没有显著的变化,并且抑制剂油菜素吡咯(Brassinazole,Brz)使得所有酶活性均比对照组酶活性降低。而酶含量实验结果显示除了PEPC和GAPDH含量没有显著的增加以外,其余酶含量都显著增加(p<0.05)。3.采用荧光定量PCR技术,检测了不同浓度EBR和不同时间处理条件下,对玉米幼苗、离体玉米叶片、玉米叶片原生质体中暗反应相关酶编码基因表达量的影响。结果表明,无论是处理玉米幼苗叶片、离体叶片还是原生质体,EBR都可以显著提高基因的表达量,最好的处理方法分别是:玉米幼苗宜用0.1、0.2、0.5μmol/L的EBR处理24 h;离体叶片宜用0.05、0.1、0.2μmol/L的EBR处理6 h;原生质体宜用0.1、0.2 nmol/L的EBR处理12 h。4.根据玉米基因组数据,扩增获得Zmrcaβ基因上游约1000bp的启动子序列,命名为Prcaβ。扩增获得Zm PEP基因和Zm FBPc基因上游约1500bp的启动子序列,分别命名为PPEP、PFBPc。用Plant CARE网站对Prcaβ、PPEP、PFBPc的序列进行分析,三者都含有启动子基本结构、ABA、Me JA等激素响应元件以及光响应元件等。并构建了启动子瞬时表达载体Prcaβ-LUC和PPEP-LUC,可用于实验室后续的瞬时表达实验。
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