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TLR4(Toll-like receptor 4)是九十年代末发现的,是TLRs受体家族中的一员,属于一型跨膜蛋白结构,分为胞外区、跨膜区和胞内区,胞外区是富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)的N端。TLR4作为LPS(存在于细胞壁外膜中的内毒素成分,在革兰阴性菌感染的致病机理中起着十分重要的作用)的最重要的模式识别受体.,是将LPS的刺激信号直接传入细胞内的一种跨膜信号受体,在介导革兰氏阴性细菌及其LPS的宿主反应中发挥关键作用。TLR4作为LPS信号转导受体,通过MyD88蛋白与IL-lR信号转导途径重合,最终导致NF-κB的激活,引起各种炎症因子基因表达。由于TLR4基因为免疫相关基因,本实验将其作为猪抗病育种的候选基因进行研究。本实验主要研究猪TLR4基因的多态性及功能,利用PCR-SSCP方法检测TLR4基因在野猪、民猪、北京黑猪、长白、大白和杜洛克六个猪(品)种中的多态性,探讨不同基因型在不同品系(种)间的分布规律;构建野生型和突变型真核表达载体,瞬时转染到PK-15细胞,用LPS诱导细胞;用荧光素酶检测信号传导通路NF-κB活性;利用Real-time PCR方法检测LPS诱导前后细胞因子IL-6的表达量。主要研究结果如下:1利用PCR-SSCP方法在TLR4基因外显子3和3’UTR上共寻找到5个单核苷酸突变,其中有3个突变属于错义突变。群体遗传学分析表明,所检测的5个位点中,6个品种间基因型的分布均存在着极显著的差异(P<0.01)。2成功将TLR4基因CDS 611bp处进行定点突变,并构建了野生型和突变型pcDNA3.1+- TLR4真核表达载体。3将表达载体、pNF-κB荧光素酶质粒和海肾荧光素酶质粒以10:10:1的量瞬时转染猪肾上皮细胞(PK-15)24h,后用1μg/ml的LPS诱导细胞12h后NF-κB转录活性最高(P<0.05)。4荧光素酶活性检测结果为,过表达野生型与突变型TLR4相比,未诱导LPS组两者之间NF-κB活性存在显著差异(P<0.05);而诱导LPS组两者之间有极显著差异(P<0.01)。过表达野生型TLR4可促进LPS诱导的NF-κB活性,而过表达突变型TLR4对LPS诱导的NF-κB活性无明显影响。5过表达野生型与突变型TLR4相比,未诱导LPS组两者之间在转录水平的IL-6表达量存在显著差异(P<0.05);而诱导LPS组两者之间有极显著差异(P<0.01)。过表达野生型TLR4可促进LPS诱导的PK-15细胞中转录水平的IL-6的表达量(P<0.05),而过表达突变型TLR4对LPS诱导的IL-6的表达量无明显影响。