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四环素类（tetracyclines,TCs）抗生素是一类广谱性抗生素,主要包括四环素（Tetracycline,TC）、金霉素（Chlortetracycline,CTC）、土霉素（Oxytetracycline,OTC）、强力霉素（Doxycycline,DC）、地美环素（Demeclocyline,DMC）、米诺环素（Minocycline,MNC）、美他环素（Metacycline,MTC）等,在临床及兽医领域主要用于治疗各种由细菌引起的感染性疾病,但由于禽畜养殖中长期的违规滥用,使其大量残存在动物源性食品中,长期食用此类产品将对人体健康造成极大伤害,同时环境中大量残留也会造成生态破坏。因此,建立高通量、快速、简便的检测方法对TCs物残留检测具有重大意义。目前,关于TCs药物残留检测方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法等,此类检测方法仪器昂贵、样品前处理复杂、操作繁琐,不适合现场快速检测。而基于抗原抗体特异性结合的免疫分析检测方法不仅操作简单、快速、灵敏度高、特异性强,而且在大批量样品以及现场筛查方面具有极大地优势。本研究为获得广谱性的TCs单克隆抗体（TCsm Ab）,在成功制备TC人工抗原,免疫BALB/c小鼠后,选择敏感性最好的小鼠并通过细胞融合技术和单克隆抗体技术筛选出可稳定分泌TCsm Ab的群选性细胞株,然后利用体内腹水诱生法大量制备TCsm Ab,并建立了TCs的间接竞争ELISA检测方法（ic-ELISA）,可实现样品中TCs的多残留检测。1.TCs人工抗原的合成及鼠源多抗血清的制备为制备广谱性的TCs单克隆抗体,在最大程度保留TCs共同结构下,分别采用甲醛法和重氮化将TC与载体蛋白偶联合成人工抗原,采用紫外扫描、SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其偶联效果。结果显示,人工抗原特征吸收峰位置及峰型相比TC和载体蛋白均发生变化,偶联蛋白迁移速率明显小于载体蛋白,初步判断人工抗原偶联成功。然后用免疫原免疫BALB/c小鼠,其中甲醛法所制备的免疫原的免疫效果较好,所获鼠源多抗血清效价高达1:51200,对TC、OTC、CTC、DC的半数抑制浓度(IC50)分别为23.00、56.10、71.88、41.07 ng/m L,与其他类抗生素如氯霉素（CAP）、红霉素（EM）、庆大霉素（GM）无交叉反应。2.TCs单克隆抗体的制备及其特性鉴定选取免疫小鼠中效价高、敏感性最好的小鼠作为融合对象,通过细胞融合技术将小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用ELISA筛选体系对融合细胞进行筛选,选取阳性杂交瘤细胞进行扩大培养和亚克隆,最终筛选出3株可稳定分泌TCsm Ab的杂交瘤细胞株,分别命名为2B6、3E5、7F11,其中,3E5细胞株产生的TCsm Ab对四种TCs（TC、OTC、CTC、DC）的抑制作用最好,为研究需要的广谱性单抗。经测定其细胞上清效价为1:3200,采用体内诱生腹水法大量制备TCsm Ab,所获腹水效价高达1:256000,该单克隆抗体的亚型为Ig G1型,亲和常数Ka为3.94×108L/mol,对TC、OTC、CTC、DC的半数抑制浓度(IC50)分别为0.62、1.45、1.86、1.14 ng/m L,存在较大交叉反应,但与其他类抗生素如CAP、EM、GM无交叉反应。3.TCs间接竞争ELISA检测方法的建立基于获得的TCsmAb,通过对工作浓度和工作时间进行优化,建立了间接竞争ELISA检测方法（ic-ELISA）。确定了ic-ELISA的最佳工作浓度为:包被抗原稀释1:8000倍,抗体3E5稀释1:6000倍,最佳工作时间为一抗孵育25 min、二抗孵育45 min、显色15 min。在此工作条件下,建立了抗体3E5对TC的标准抑制曲线,线性回归方程为=-0.3447x+0.3671,R2=0.9888,对TC的IC50为0.41 ng/m L,线性范围为:0.06～3.0 ng/m L。经鉴定,ic-ELISA方法的灵敏度为0.03 ng/m L,对OTC、CTC、DC的IC50分别为0.92、1.48、0.60 ng/m L,存在较大交叉反应,但对其他类抗生素如CAP、EM、GM无交叉反应。牛奶添加回收试验中TC、OTC、CTC、DC的回收率分别为86.3%～98.9%、85.7%～101.6%、85.3%～100.3%、82.8%～90.8%,变异系数均小于15%。本研究建立的ic-ELISA方法可实现样品中TCs的多残留检测。