肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,每年累及超过60万人的生命,成为最为常见的肿瘤相关死亡病因之一[1,2]。HCC的致病因素复杂,常见的HCC高危因素有慢性肝炎病毒感染,包括HBV和HCV的感染,长期大量摄入酒精及暴露于致癌物质如黄曲霉素B等[3]。近些年,肥胖和糖尿病引起的非酒精性脂肪性肝炎相关HCC的发病率有上升趋势[4]。HCC发病隐匿、临床症状不典型,早期诊断率低,目前对于早期HCC主要的治疗方式是手术切除,辅以射频消融、化疗栓塞等治疗,但患者术后复发率高,有50%-70%的患者在术后5年内复发或转移[5,6]。中晚期HCC患者治疗选择非常有限;肝移植是治疗HCC的有效方式,但由于供肝短缺,受益患者范围有限;索拉非尼能够使晚期肝癌患者受益,但是有效率较低。因此近些年的研究显示,手术治疗联合免疫治疗、分子靶向治疗的HCC综合治疗模式是未来HCC精准治疗的发展方向[7,8]。由于HCC发病因素复杂,形成了具有高度异质性的肿瘤微环境,表现在不同患者间肿瘤存在差异、同一患者不同病灶及同一肿瘤结节内部细胞存在异质性[9],因此需要制定针对HCC患者个体肿瘤分子病理分型的个体化治疗方案,可以避免盲目用药和不必要的药物毒副作用。肿瘤个体化治疗需要在治疗前制定针对性的治疗方案,还需要在治疗过程中对肿瘤患者进行实时、动态的监测。目前临床上常用的HCC监测方式包括血清AFP测定和超声检查,但其对早期HCC的诊断敏感性只有40%-50%,CT、MRI检查在临床上可选,但由于检查费用较高、本身辐射作用强及患者依存性较差而不易反复多次进行[6,10]。此外,传统HCC监测方式不能反映肿瘤内部和肿瘤之间的异质性,因此迫切需要研发出用于肝癌早期诊断和实时动态监测的生物标志物。目的:评估基于第二代测序技术的肝癌相关基因变异检测是否可以用于分析肝癌的分子分型,观察肝癌细胞系肿瘤相关基因的变异,是否可用于肝癌的伴随分子诊断手段。材料和方法:本研究分为两个部分,第一部分,利用基于第二代测序技术的目标基因靶向测序技术,对7个常见hcc细胞系dna325个肿瘤相关基因进行捕获测序。分析dna中的肿瘤相关突变基因及突变负荷率,比对出差异基因,以及差异基因的突变趋势。第二部分选择收集郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)肝胆胰腺外科29例外科手术治疗的hcc患者标本,包括术前1天血浆标本、外周血白细胞(pbmc)及手术切除的肿瘤组织和癌旁组织。选用覆盖第一部分的50个常见肿瘤原癌基因和抑癌基因的扩增子试剂盒,基于illuminahiseqxten测序平台,对血浆cfdna、肿瘤组织dna及癌旁组织dna进行靶向扩增子测序,纳入等位基因突变频率(mutantallelefrequency,maf)高于1%的基因位点。比较hcc患者术前血浆cfdna、肿瘤组织dna及癌旁组织dna的高频突变基因的变异,pbmc来源的基因组dna作为对照用于排除生殖细胞变异。同时对血浆cfdna中基因突变与患者肿瘤负荷进行相关性分析。结果:本研究的第一部分,本研究采用基于肿瘤基因捕获的高通量测序技术检测7种肝癌细胞株(huh-7,hep3b,sk-hep-1,mhcc97h,mhcc97l,hepg2,hepg2.2.15)的体细胞突变。采用包含325个肿瘤相关基因panel的罗氏nimblegen定制序列捕获系统,对细胞株样本进行目标区域的捕获和双端测序。测序结果显示目标区域平均覆盖率达99.7%,平均测序深度约1000×,共检出100个基因发生突变,包括344个非同义突变。其中有38个与癌症密切相关的突变基因富集于5条致癌信号通路:染色质重塑,notch,mapk,p53和wnt/β-catenin通路。与hcc患者体细胞突变的前期报道比较,肝癌细胞株中染色质重塑和notch信号通路中基因突变负荷更高。四种来自不同hcc患者建系的肝癌细胞株(huh-7,hep3b,sk-hep-1,hepg2)有不同突变模式,但同一个克隆来源的肝癌细胞株突变呈现较大相似性。本研究的第二部分前瞻性的观察了靶向测序技术可检测到肿瘤相关高频突变基因。28例患者肿瘤组织中有27例(96%)样本检测到至少2个基因突变(中位突变基因数6,2-18不等),1例患者肿瘤组织未测到任何基因的突变,肿瘤组织中检测到的35个突变基因中,以tp53、atm、alk的突变频率最高,分别是50%(14/28)、39%(11/28)和39%(11/28);全部29例(100%)患者血浆cfdna中检测到肿瘤相关基因突变(中位突变基因数27,6-47不等),其中包括大量低频突变基因。比较同一患者肿瘤组织dna和术前血浆cfdna的基因突变,发现28例有配对样本的患者中,21例(21/28,75%)患者血浆cfdna与肿瘤组织dna中检测到至少一个完全一致的基因突变,其中以tp53、pdgfra、kit、及npm1突变频率最高,分别是33%(7/21)、23.8%(5/21)、19%(4/21)及19%(4/21);7例(7/28,25%)患者血浆cfdna与肿瘤组织dna中未检测到一致的基因突变,其中1例患者肿瘤组织dna中未检测到任何基因的突变,其血浆cfdna中检测到包括cdkn2a、egfr等基因在内的低频突变。此外,28例有配对样本的hcc患者中,17例(17/28,61%)患者癌旁组织dna中检测到与肿瘤组织dna中完全一致的基因突变,其中14例(14/17,82%)患者肿瘤组织dna与癌旁组织dna一致的突变基因在血浆cfdna中可检测到,其中高频突变基因包括pdgfra、kit及npm1等基因。比较afp水平与血浆cfdna突变检测的结果显示,29例患者中有14例(48.3%)患者afp阳性(>20ng/ml),24例(82.7%)患者血浆cfdna中检测到肿瘤相关基因突变及15例afp阴性患者中有13例(86.7%)患者血浆cfdna中检测到肿瘤相关基因突变;并且血浆cfdna和肿瘤组织dna有一致突变基因的患者血清afp水平显著高于非一致突变组患者,两组患者afp水平中位值分别是144ng/ml和2.5ng/ml(p=0.016)。本研究中,血浆cfdna浓度与患者临床病理特征无直接相关性,而肿瘤直径>5cm组患者中tp53、ctnnb1、pik3ca及cdkn2a基因的maf水平高于肿瘤直径<5cm组患者,且肿瘤多发或伴随转移的肿瘤患者中tp53、ret、fgfr3及apc基因的maf水平较肿瘤单发组患者。结论:1.本研究通过对肝癌细胞株进行肿瘤相关基因捕获测序,明确了实验室常用肝癌细胞模型的体细胞突变,也初步揭示相同和不同克隆来源的肝癌细胞株的突变模式。2.HCC患者血浆cfDNA可能替代肿瘤组织活检,作为HCC突变基因筛查的分子标志物;本研究中HCC患者血浆cfDNA中基因突变的MAF水平与肿瘤负荷显著相关,提示血浆cfDNA可能成为HCC辅助诊断的分子标志物。