论文部分内容阅读
目的：弓形虫病是世界范围的严重机会致病性寄生虫病,也是一种重要的人兽共患原虫病。全球人口大约有30％是携带者,在欧洲是最常见的寄生虫病。由于目前尚没有国产的批准上市弓形虫抗体检测试剂盒,检查和处理尚未规范,常见假阳性反应,导致不同实验室间的结果缺乏可比性,临床诊断和治疗缺乏可靠的依据。本研究旨在利用血清蛋白质组学技术筛选弓形虫病诊断候选分子,并进一步评估其在弓形虫病诊断中的作用。 方法：弓形虫RH株速殖子可溶性蛋白经过二维电泳(2-DE)后,用不同期弓形虫感染患者血清进行Western-blot分析,将Western-blot结果与同源的经考马斯亮蓝染色的2-DE凝胶比对,切取匹配的点用胰酶消化后进行质谱测序,分析质谱测序结果,从中挑选潜在可能的生物标志物进一步克隆重组及原核表达。将纯化后的原核表达产物包被于聚苯乙烯微量反应板,用ELISA方法评估其在弓形虫病诊断中的价值;同时将BALB/c小鼠口服弓形虫PRU株包囊,分阶段定期收集小鼠血清,用ELISA方法检测血清中的特异性IgG及IgM抗体的动态变化情况。 结果：利用血清蛋白质组学方法从弓形虫RH株速殖子中筛选出50多个具有免疫反应性的蛋白点,其中慢性感染IgG阳性组胶片上有21个阳性点能够与同源的2-DE凝胶明确匹配,质谱测序结果显示,这21个点对应13种不同的蛋白质;急性感染IgM阳性组胶片上有3个阳性点能够与同源的2-DE凝胶明确匹配,质谱测序只检测出其中1种蛋白:棒状蛋白2(ROP2)。进一步成功表达出了重组蛋白ROP2186-533(第186到533的氨基酸序列),纯化后的rROP2186-533蛋白浓度高达6mg/ml;诊断评估中的ELISA结果显示,rROP2186-533对弓形虫特异的IgM和IgG抗体的敏感性分别为100%和0%,并且IgM抗体诊断特异性达到了100%,与正常对照组相比具有显著性差异(P＜0.001)。 BALB/c小鼠口服PRU包囊,用rROP2186-533蛋白包被微孔板的ELISA结果显示:感染2天后小鼠血清中的特异性IgM抗体迅速升高,至14天达到峰值后迅速降低,28天时特异性IgM抗体消失,其滴度与感染前相同。此IgM抗体分布趋势与其他学者研究结果一致;而IgG抗体在感染全程中均为阴性。 结论：利用血清蛋白质组学技术成功地从弓形虫RH株速殖子中筛选出了ROP2,并成功克隆和重组了rROP2186-533;研究结果证明,rROP2186-533是特异性诊断IgM抗体的弓形虫感染诊断候选分子,能明确的鉴别急性期感染。同时也证明,血清蛋白质组学方法是筛选疾病诊断候选分子的强有力手段,是切实可行的。该研究为开发可供临床应用的高特异性和高敏感性的诊断试剂奠定了基础。