14-3-3蛋白是所有真核生物细胞中均普遍存在、具有高度保守性,在大多数生物中,由不同基因编码的蛋白家族。该蛋白自从发现以来就因其功能的多样性,广泛地参与各种抗逆生理过程,如细胞信号转导、细胞周期的调控、转录因子对环境的应答、细胞的凋亡及蛋白质跨膜转运等,因此受到广泛的关注并有多方面的研究。14-3-3蛋白的主要功能是可作为接头／支架蛋白与其他蛋白结合,参与蛋白质-蛋白质之间的相互作用,进而通过多种机制调节蛋白的生物学功能。14-3-3蛋白以“桥梁”的作用将细胞中两个原本不相近的蛋白连接到一起,发生相互作用,进而引发一系列的生理反应。因此研究该蛋白在胁迫下的应答机制,可以研究与其相互作用的多种蛋白,同时可筛选出未知功能的蛋白,进一步完善14-3-3b蛋白相互作用蛋白网络,也可为进一步研究胁迫应答机制提供理论基础。酸性土壤中的铝毒是影响作物生长和产量的主要限制因子。研究作物铝毒胁迫下的耐性机制有利于改善作物受铝毒毒害时的生长和产量。云南是蚕豆的重要产地,云南地区的土壤主要是红壤,土壤酸化严重。因此,有必要对蚕豆的耐铝机理进行深入的研究。有关有机酸与耐铝机制的研究较多,但尚未报道14-3-3蛋白与耐铝机制的研究。本研究以云南蚕豆为实验材料,从蚕豆铝胁迫基因文库中筛选出来的14-3-3b基因(GF14-b)为对象,探讨蚕豆铝胁迫下14-3-3b蛋白的相互作用蛋白,验证了与14-3-3b蛋白相互作用的蛋白,为进一步深入研究蚕豆耐铝机理提供新的理论基础,同时也为探究蛋白质相互关系的网络节点提供理论数据。主要研究结果如下：1、从蚕豆根中提取总RNA,反转录PCR扩增获得目的基因片段GF14-b,通过TA克隆、酶切、并测序鉴定后,连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-14-3-3b,转化到大肠杆菌基因工程蛋白表达菌BL21中进行诱导表达。在1mM IPTG浓度下诱导蛋白表达,不同温度及时间梯度摸索最佳诱导条件,最终确定pGEX-4T-1-143-3b重组蛋白表达的最佳诱导条件为1mM IPTG,16℃,诱导10h,且SDS-PAGE检测蛋白表达形式以可溶性表达为主,通过GST亲和层析对目的重组蛋白进行纯化,获得相对较纯的目的重组蛋白,浓度1mg/mL,总含量为4mg。2、为了研究铝胁迫下,14-3-3b蛋白的相互作用蛋白,实验对50μM铝处理蚕豆幼苗,提取根总蛋白,测定OD595,计算植物总蛋白浓度,确定反应体系中加入1mg植物总蛋白,然后分别加入200μgpGEX-4T-1-14-3-3b纯化蛋白、3μLGST抗体、3μL14-3-3b抗体,即分别利用利用GST融合蛋白pull-down技术和体外免疫共沉淀技术进行蛋白分离筛选与GF14-b蛋白相互作用的蛋白质。通过蛋白质谱分析鉴定互作蛋白获得了18个目标蛋白,其中2个未知蛋白,10个假定推测的蛋白,1个未命名蛋白和5个已知蛋白(3-磷酸甘油醛脱氢酶、NADH脱氢酶、钙依赖的磷脂结合蛋白、delta-氨基乙酰丙酸脱水脱水酶和DNA甲基转移酶)。3、分析质谱鉴定获得的蛋白结果,对其中的3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH脱氢酶两个蛋白进行了far-western验证,结果发现在相应的37kd和81kd位置出有微弱的条带,证实了该两个蛋白与14-3-3b蛋白的互作关系。进一步用GST-pull-down方法检测50μM铝时间梯度处理下互作蛋白的互作水平,结果发现随时间延长互作关系更为密切。同时RT-PCR分析了50μM铝时间梯度处理的蛋白mRNA表达水平。两个编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因均不同程度的上调,编码NADH脱氢酶的两个基因其中nad4基因表达也有所上调,说明14-3-3b蛋白在铝胁迫下与这两个蛋白相互作用。