论文部分内容阅读
免疫细胞生物学和免疫分子生物学的进展，推进了免疫学在肿瘤治疗中的应用。现今，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗的基本手段之一，其中细胞介导的过继免疫治疗为当前研究的热点之一。通过给肿瘤患者输入特异性的或非特异性的具有抑制肿瘤细胞生长的免疫效应细胞，可直接杀伤肿瘤细胞，或在患者体内诱发机体免疫反应，达到抑制和治疗肿瘤的目的。目前有关肿瘤免疫效应细胞的研究和临床的初步资料提示，细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer CIK）细胞是一种新型、高效的具有广谱杀瘤活力的MHC非限制性的免疫效应细胞，具有增殖速度快、杀伤活性高、临床应用副作用小等优点，是目前发现的杀瘤活性最强的免疫效应细胞之一，在肿瘤免疫治疗中显露巨大应用价值。树突状细胞（Dendritic cells DC）是迄今发现的功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell APC)。体内、体外研究均表明DC是机体免疫反应的始动者，可有效的激活细胞毒T淋巴细胞(CTL)介导的免疫反应，提高肿瘤宿主免疫效应细胞的细胞毒活性，诱发肿瘤宿主对特异性抗原的特异性免疫应答。目前已应用DC疫苗临床治疗非何杰金氏淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤患者。本实验通过常规分离人外周血单个核细胞，应用相应细胞因子体外诱导分化出DC和CIK细胞，并将DC和CIK细胞共培养，观察DC与同源CIK细胞共培养后培养物的细胞形态学、体外增殖活性、细胞表型和细胞毒活性变化，对CIK和DC-CIK共培养细胞抗瘤机制做进一步研究，对过继免疫疗法进行新的探索。 第一部分 树突状细胞与CIK细胞共培养后体外增殖和杀瘤活性研究目的 观察树突状细胞与同源CIK细胞共培养后培养物的细胞形态学、表型、增殖活性变化，及DC 对CIK细胞细胞毒活性的影响。方法 提取健康供血者的PBMC,应用相应的细胞因子体外诱导出DC与CIK细胞；用A549肺腺癌细胞裂解液抗原冲击DC，经抗原致敏与未经抗原致<WP=5>敏的DC分别和CIK细胞共培养，动态观察CIK细胞和DC-CIK培养物的增殖活性；在流式细胞仪上做动态培养物的表型分析；定量检测细胞培养上清中的IFN-γ和IL-12的分泌水平；并用MTT法检测CIK细胞、DC-CIK共培养细胞和抗原致敏的DC-CIK共培养细胞杀伤A549肺腺癌细胞和BEL-7404肝癌细胞的活性。结果 （1）CIK细胞和DC共培养2天内，二者增殖性能无明显区别。之后，DC-CIK共培养细胞的增殖速度明显快于同源CIK细胞（p<0. 05），培养15天时二者增殖倍数相差2.2-3.2倍。19天时二者增殖倍数相差达2.9-4.1倍，平均增殖倍数分别为307倍和1029倍。经A549肺腺癌细胞抗原冲击的DC可使CIK的增殖速度进一步提高，增殖倍数达1092倍。（2）以肿瘤细胞A549和BEL-7404为靶细胞,在1.25:1-10:1的效靶比范围内, DC-CIK共培养细胞对A549靶细胞的杀伤活性一般均高于同源CIK细胞，经A549细胞抗原致敏的DC-CIK共培养细胞对A549靶细胞的杀伤活性有进一步的提高，与单纯CIK细胞组比较，差异显著（p<0.05）。虽然DC-CIK共培养细胞组和A549细胞抗原致敏的DC-CIK共培养细胞组对BEL-7404靶细胞的杀伤活性高于CIK细胞组，但三种效应细胞对BEL-7404靶细胞的杀伤活性无显著差异。（3）DC与CIK细胞共培养后相互作用，促进彼此的成熟。CIK细胞可进一步增加DC表面分子CD40，CD80和HLA-DR的表达。随培养时间的延长，CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞和CD8+细胞的百分含量逐渐升高，而CD45RA+细胞的百分含量逐渐减少；经DC作用后的CIK细胞，CD3+CD56+双阳性细胞和CD8+细胞的百分含量进一步升高，而CD45RA+细胞的百分含量进一步减少；经抗原致敏的DC作用后的CIK细胞，其细胞群中各细胞的百分含量变化更大。（4）培养9天的CIK细胞、DC-CIK共培养细胞和A549裂解液抗原致敏的DC-CIK共培养细胞上清液中Il-12，IFN-γ的分泌水平逐步增加，IFN-γ分泌水平的变化尤为明显。结论 DC与CIK细胞共培养后促进了彼此的成熟。DC与CIK细胞共培养细胞是一种强于CIK细胞的免疫活性细胞，经肿瘤抗原冲击的DC能进一步提高CIK对肿瘤细胞的杀伤活性，具有更广阔的应用前景。第二部分 树突状细胞与CIK细胞治疗结肠癌血源性肺转移的实验研究目的 观察树突状细胞与同源CIK细胞共培养后治疗结肠癌血源性肺转移的可能性。<WP=6>方法 提取健康供血者的PBMC,应用相应的细胞因子体外诱导出DC与CIK细胞；用Lovo结肠癌细胞裂解液抗原冲击DC，经抗原致敏与未经抗原致敏的DC分别和CIK细胞共培养。将Lovo结肠癌细胞经尾静脉注射给Balb/c裸鼠建立结肠癌血源性肺转移模型，应用CIK细胞、DC-CIK细胞和Lovo结肠癌细胞裂解液致敏的DC-CIK细胞进行免疫治疗。除对照组外，分别于接种肿瘤的第3，7，10天尾静脉输入各组效应细胞，观察裸鼠生存时间。Trizol法抽取组织或细胞中的总RNA，采用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）法测定Lovo结肠癌细胞、裸鼠正常组织和癌组织CEA基因的表达。结果 经尾静脉注射的Lovo结肠癌细胞可播散致肺，导致荷瘤裸鼠死亡。应用树突状细胞和CIK细胞进行免疫治疗，能显著抑制肿瘤的生长，延长荷瘤裸鼠生存时间，抑制转移病灶的形成及其引起的荷瘤裸鼠死亡，疗效?