静脉曲张是最常见的外周血管疾病，在30-70岁的人群中静脉曲张的发病率高达10-40％。静脉曲张除了影响美观外还可以严重影响了病人的生活质量及降低社会的劳动力。目前的治疗手段包括手术治疗，血管内射频及激光消融和泡沫硬化剂的注射，但是术后10年内的复发率约为1/3，而后两种方法虽然3年内的治疗效果与手术相似，但其远期效果尚不得而知。因此从长远的眼光来看，研究静脉曲张发生的分子及细胞机制，对于寻找新的治疗靶点及发展新的治疗策略具有重要的意义。　　 近年来越来越多的证据表明原发性静脉壁薄弱是静脉曲张致病的始发因素。是什么导致了原发性静脉壁的薄弱？正常情况下，胶原、弹性纤维及平滑肌细胞控制着静脉壁的可扩张性，平滑肌细胞控制静脉壁主动张力的维持，而胶原及弹性纤维控制着静脉壁被动张力的维持，无论哪种成分有缺陷，都可以导致静脉壁张力的丧失。从形态学及功能学上都有研究提示静脉曲张病人的血管平滑肌细胞表型或者说其分化状态发生了改变，而这种改变可以引起静脉壁一系列的变化，包括静脉壁对内源性血管收缩因子的反应的降低导致静脉壁主动维持张力的能力下降及细胞外基质的紊乱导致静脉壁被动维持张力的能力下降，从而导致了静脉壁的薄弱和扩张。但是以往的研究多通过电子显微镜观察其超微结构的改变来推断曲张静脉平滑肌细胞发生的改变，也有研究通过培养的静脉平滑肌细胞观察其某一方面的功能，比如有研究比较曲张静脉源性平滑肌细胞与正常静脉源性平滑肌细胞胶原I及胶原III的合成，发现体外培养的平滑肌细胞所合成的胶原可以反应组织中胶原的情况，体外培养的平滑肌细胞在一定程度上保留了其在体内的生物学特性，因此我们可以利用体外培养的平滑肌细胞来分析其在体内的生物学特性。目前还没有一个研究全面的探讨静脉曲张病人血管平滑肌细胞的生物学行为与正常静脉平滑肌细胞之间的差别。　　 有研究者认为静脉曲张病人平滑肌细胞的生物学行为的改变有可能是因为基因的缺陷所造成的，因此它才能在体外培养时也表现出其异常的功能。流行病学研究也提示静脉曲张的发病具有高度的遗传倾向。近年来大量的研究已经通过不同的方法筛选曲张大隐静脉与正常大隐静脉差异表达的基因，试图从中找出静脉曲张致病相关基因。目前筛选出来的差异表达基因涉及到细胞代谢、细胞外基质的组装及细胞对外界刺激的反应包括细胞骨架、肌动蛋白的组装等方面。但是这些差异表达的基因究竟在静脉曲张的发病机制中发挥了什么作用，目前的报导很少。　　 我们的前期研究发现一种叫Desmuslin的基因在曲张静脉中的表达明显下调。Desmuslin又称为β-synemin，是一种VI型中间丝蛋白，最初被认为是α-dystrobrevin蛋白结合蛋白，α-dystrobrevin蛋白是dystrophin(抗肌萎缩蛋白)复合物(DAPC)的组成部分，DAPC是细胞外基质与细胞内骨架之间联系的桥梁，为骨骼肌细胞提供机械支持，DAPC的病变与多种骨骼肌的遗传性疾病相关。在平滑肌细胞中，中间丝蛋白与微管、微丝一起共同组成平滑肌的细胞三大骨架，长期以来中间丝蛋白网被认为只是维持机械完整性的固定的细胞结构，然而目前的研究认为中间丝细胞骨架是一个动态的信号平台，其生物学功能涉及细胞生长、分化及其它生物学行为的调节。动物模型表明中间丝蛋白是维持细胞构架及细胞机械完整性所必需的细胞骨架，它为细胞提供了一个柔韧的胞浆结构，使其可以耐受外界的不同刺激，中间丝蛋白功能的减弱引起细胞过度脆弱不能承受各种不同的生理刺激，可以导致多种遗传性疾病。静脉曲张病人中Desmuslin表达的下调是否导致了平滑肌细胞的功能的变化从而导致原发性静脉壁薄弱及静脉曲张的发生呢？　　 本研究是第一个通过比较体外培养静脉曲张病人及正常大隐静脉病人的平滑肌细胞全面评估平滑肌细胞生物学行为的研究，且本研究通过RNA干扰技术下调Desmuslin在正常大隐静脉平滑肌细胞中的表达后观察平滑肌细胞表型及功能的变化，从而探讨Desmuslin与静脉曲张发生及发展的关系。本研究是对前期研究筛选出来的静脉曲张差异表达基因Desmuslin功能学的研究。在本研究中，我们假设静脉曲张病人血管平滑肌细胞内在生物学行为的改变是导致静脉曲张发生的始发因素，而我们发现静脉曲张病人的平滑肌细胞具有的内在特性包括增殖、迁移及细胞外基质的合成功能的增强有利于静脉曲张的形成，而Desmuslin的低表达可以导致正常平滑肌细胞表型及功能发生类似曲张静脉源性平滑肌细胞的改变。因此我们认为在静脉曲张的病人中由于Desmuslin的低表达，导致其中膜平滑肌细胞的内在生物学特性的改变，不仅导致静脉壁主动张力维持障碍，而且由于影响了细胞外基质的周转，导致了细胞外基质的紊乱，也影响了静脉壁被动张力的维持，最终导致原发性的静脉壁薄弱及静脉曲张的形成。　　 第一部分、体外培养曲张静脉平滑肌细胞与正常静脉平滑肌细胞生物学行为的区别　　 目的：　　 本研究的目的是通过比较体外培养的正常静脉源性的平滑肌细胞与曲张静脉源性平滑肌细胞生物学行为，探讨静脉中层平滑肌细胞在静脉曲张发病中的作用。　　 方法：　　 1.分别收集原发性大隐静脉曲张病人的大隐静脉及无静脉曲张病人的正常大隐静脉，然后用贴块法进行曲张静脉源性平滑肌细胞及正常静脉源性平滑肌细胞的原代培养，并通过细胞形态及肌动蛋白免疫荧光染色法鉴定平滑肌细胞的纯度。　　 2.分别利用台盼蓝染色细胞计数法及氚标记的胸腺嘧啶核苷酸([3H]-Thymdine)掺入法比较两组平滑肌细胞的增殖。　　 3.利用划痕实验比较两组平滑肌细胞的迁移能力。　　 4.利用免疫印迹技术比较两组细胞收缩表型依赖标志蛋白的表达。　　 5.利用氚标记的脯氨酸([3H]-Proline)掺入法比较两组细胞总胶原的合成。　　 6.利用酶联免疫粘附实验及免疫印迹技术分别检测培养基内及细胞层内基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的浓度。　　 7.采用SPSS10.0统计软件分析实验结果。计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验，各检验过程均以P≤0.05认为具有统计学意义。　　 结果：　　 1.贴块法培养的平滑肌细胞镜下可见明显特征性“峰-谷”样生长。肌动蛋白免疫荧光法鉴定平滑肌细胞及其纯度，肌动蛋白染色阳性的细胞数占总细胞数的90％以上。　　 2.在生长曲线的第5-7天，曲张静脉源性平滑肌细胞增殖明显高于正常静脉源性平滑肌细胞，平台期时，曲张静脉源性平滑肌细胞计数为正常静脉源性平滑肌细胞计数的1.5倍。同代数的两组平滑肌细胞相比曲张静脉源性平滑肌细胞经10％FBS刺激48h后DNA的合成约为正常静脉源性平滑肌细胞的1.7倍。　　 3.曲张静脉源性平滑肌细胞比正常静脉源性平滑肌细胞表现出增强的迁移能力，发生迁移的细胞数约为正常静脉源性平滑肌细胞的2.8倍。　　 结论：　　 在本研究中，我们发现培养的正常静脉源性的平滑肌细胞与曲张静脉源性的平滑肌细胞在表型和功能上确有不同，曲张静脉源性平滑肌细胞表现出明显增强的增殖、迁移、合成功能及明显降低的收缩表型依赖性标志蛋白表达。我们的数据表明静脉曲张病人的平滑肌细胞具有内在的生物学特性，而正是这种特性有利于静脉曲张的形成。　　 第二部分、Desmuslin下调对平滑肌细胞表型的影响　　 目的：　　 本研究的目的是通过RNA干扰技术下调Desmuslin在正常大隐静脉平滑肌细胞中的表达，观察Desmuslin蛋白表达下调后平滑肌细胞表型及功能的变化，从而推断该蛋白与静脉曲张发生及发展中的关系。　　 方法：　　 1.利用RNA干扰技术下调Desmusiin基因在平滑肌细胞中的表达，并利用RT-PCR及Western blot检测转染效率。　　 2.利用Western blot比较下调Desmuslin基因的表达后平滑肌细胞收缩表型依赖标志蛋白的表达。　　 3.利用[3H]-Proline掺入法比较下调Desmuslin的表达后总胶原的合成。　　 4.分别利用酶联免疫法及Western blot比较下调Desmuslin的表达培养基内及细胞层内基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的含量。　　 5.免疫荧光染色法比较下调Desmuslin表达后平滑肌肌动蛋白骨架的变化。　　 6.采用SPSS10.0统计软件分析实验结果。结果用平均值±标准差表示，多组之间的比较用单因素方差分析，两组之间的比较用配对t检验，p<0.05为差异有统计学意义。　　 结果：　　 结论：　　 在本研究中，我们发现在正常血管平滑肌细胞中下调Desmuslin的表达后，正常静脉源性平滑肌细胞发生像曲张静脉源性平滑肌细胞一样去分化的改变，收缩表型标志性蛋白明显下调及细胞外基质的分泌的明显增强，平滑肌α肌动蛋白不仅表达量降低，其骨架结构也发生了重组，可以导致其收缩功能明显下降。因此我们可以推断Desmuslin是维持血管平滑肌细胞分化表型(收缩表型)所必需的蛋白，因此其缺乏引起平滑肌细胞去分化，从而导致原发性静脉壁薄弱。