近年来，靶向破坏肿瘤脉管系统在肿瘤生物学和治疗学领域上受到众多研究人员的关注。肿瘤血管化提供肿瘤持续的发生发展所必需的氧及营养物质。同时肿瘤通过血管获得潜在的迁移能力，并且由此能够缓解其无限增殖导致的低氧环境。血管发生则是促血管生成蛋白的产生导致现存的脉管萌发并在循环回复中使内皮细胞形成新的脉管网络。若这种血管发生受到抑制或改变，肿瘤则无法从新生脉管系统中得到营养的供给，那么这些肿瘤组织将会饥饿而死。于是，靶向脉管生成而治疗肿瘤的发生发展显得尤为重要。同时这些脉管网络受肿瘤微环境影响，导致多种蛋白表达改变。经过一系列的分子技术探究得到一些集中过表达的蛋白，其中较为特别的就是肿瘤内皮标志物8（TEM8），其在多种肿瘤血管中高表达。TEM8是Ⅰ型跨膜蛋白，在胚胎细胞及肿瘤脉管系统中高表达，并且在种间高度保守，能够促进肿瘤相关的血管生成，并作为PA（炭疽毒素保护性抗原）的受体介导炭疽毒素进入宿主细胞，但其确切的生理功能还未能明确。一些研究发现，TEM8促进肿瘤细胞的迁移和粘附，并在肿瘤血管生成中发挥关键性作用。在体外研究中得知，TEM8在多种内皮细胞的功能中具有重要作用，其胞外区能够结合细胞外基质蛋白，同样也能够结合炭疽毒素保护性抗原。在临床样本及研究中均显示TEM8在肿瘤内皮细胞中过表达，而在正常成熟组织中，TEM8的表达零星不规则并且远远低于肿瘤内皮组织。这些发现均暗示了在成熟细胞内TEM8高表达往往是由于异常的脉管生成，如肿瘤脉管系统，所以可以将TEM8作为靶向肿瘤内皮组织的治疗靶点。TEM8具有三种天然突变体，其中IsoformⅠ具有563个氨基酸残基，包括320个氨基酸的胞外区、23个氨基酸的跨膜区以及221个氨基酸残基的胞内区。其胞内区具有14个潜在的磷酸化位点以及一个富含脯氨酸的C端胞质区。其中TEM8的胞外区主要由包含一个金属离子结合位点（MIDAS）的vWA结构域组成，同时也是TEM8胞外蛋白质间相互作用的区域，其与integrin（整联蛋白）的Ⅰ结构域具有很高的同源性，故推测其生理功能可能与integrin相似。有报道称uPA能够通过结合integrin、EGFR等促使细胞迁移粘附及增殖。本课题组在前期工作中，构建并表达了一种抗体样分子——TEM8-F（cTEM8胞外区的vWA结构域和IgG1Fc段组成的融合蛋白），发现其具有抗血管生成能力，并能够抑制多种肿瘤细胞的生长、迁移及血管生成，然而其抗肿瘤机制并不十分清楚。在实验室前期实验中，通过免疫共沉淀实验得到TEM8新的生理性配体——uPA，并证明其与TEM8间具有一定的相互作用，同时TEM8在动物模型中具有一定的抗肿瘤作用。故本实验设想uPA与TEM8及EGFR可以发生相互作用，导致EGFR磷酸化并激活下游信号通路，故可将TEM8作为抗肿瘤发生发展的靶点。为了验证TEM8能够结合uPA、EGFR并实现其相应的生理功能，首先进行TEM8-Fc蛋白的制备，并进一步进行ELISA、基因沉默、免疫沉淀、流式细胞分析等实验，并结合实验室前期工作，说明uPA与TEM8具有一定的相互作用。流式细胞分析结果表明野生型CHO-K1能够结合PE标记的uPA，而TEM8缺陷型CHO-Pr230并不能结合uPA，说明uPA结合至CHO细胞表面依赖于TEM8的表达。基因沉默实验结果表明，在HepG2和CHO细胞中TEM8蛋白沉默大大降低了细胞对uPA的结合能力，从而说明TEM8可作为uPA除uPAR外的另一个受体。免疫沉淀实验证明TEM8与uPA之间具有一定的相互作用，且具有剂量依赖性。用纯化的TEM8-Fc蛋白与uPA之间进行非竞争性ELISA，结果显示uPA与TEM8结合力较强，结合常数为1×107。同时，在uPA刺激下进行免疫荧光实验，结果显示uPA刺激下TEM8与EGFR发生共定位现象，说明uPA能够促进TEM8与EGFR间相互作用。在上述实验基础上，对EGFR磷酸化进行研究。在EGF、uPA的刺激下，探索EGFR的磷酸化位点及磷酸化水平。实验室前期磷酸化芯片结果显示，uPA能够使EGFR Y1173位、Y845位磷酸化位点的磷酸化水平上调。为了了解uPA刺激下EGFR的磷酸化中TEM8的作用，首先在TEM8、EGFR高表达的细胞系HepG2细胞中研究EGF、uPA刺激下EGFR的磷酸化作用。综合对EGFR Y845、Y992、Y1045、Y1068、Y1086、Y1173等磷酸化位点的磷酸化水平研究，磷酸化WB结果证明uPA能够上调EGFR Y1173、Y845位的磷酸化水平，尤其显著上调Y845位磷酸化位点，说明uPA能够增强EGFR的磷酸化作用。其次，构建TEM8、EGFR过表达细胞系，选取TEM8、EGFR均低表达的HEK293F细胞，稳定转染得到TEM8/EGFR共表达的细胞系TEM8-EGFR/HEK293F，通过对TEM8-EGFR/HEK293F与EGFR/HEK293F细胞系EGFR磷酸化水平的比较，以此确定TEM8在uPA刺激EGFR磷酸化中的促进作用。在实验过程中，发现在uPA、EGF的刺激下，TEM8有入核现象，即刺激致使TEM8蛋白进入核内发生一定的生理作用。为探索TEM8入核是否为其正常生理功能，以及入核实现何种生理功能，进行了以下实验。免疫荧光层扫实验证明，在EGF刺激10min、uPA刺激15min后TEM8有明显的入核现象。为进一步确定其入核，我们将TEM8高表达的HepG2细胞进行核质分离，实验证明EGF、uPA的刺激能够明显提高TEM8在细胞核内的含量，同时细胞质中TEM8的含量相应减少，提示刺激发生后TEM8可能有入核现象。综合上述实验结果表明，TEM8作为integrin类蛋白，能够与uPA、EGFR相互作用，并能够借此调节EGFR的磷酸化水平。故可将uPA与TEM8、EGFR紧密的联系起来，且TEM8可作为uPA的新型的受体，介导uPA对EGFR的磷酸化。