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背景:肺成纤维细胞(Lung fibroblast)及由其转化而来的肺肌成纤维细胞(Lung myofibroblast)形成的成纤维细胞灶是肺纤维化疾病的主要病理特征,也是治疗肺纤维化疾病的药物靶标。目前治疗肺纤维化的药物---吡非尼酮与尼达尼布,均通过抑制肺成纤维细胞转化达到阻止肺纤维化病程的作用。我们实验室前期报道,黄芩素可以减轻博莱霉素诱导动物模型的肺纤维化,并推测可能与其下调microRNA-21(miR-21)的表达水平有关。然而迄今为止,黄芩素干预肺纤维化的分子机制仍待阐释。因此本论文将从肺成纤维细胞转化角度研究黄芩素抗肺纤维化的分子机制。实验方法:1.黄芩素下调miR-21抑制肺成纤维细胞转化的作用(1)CCK8法筛选黄芩素作用于肺成纤维细胞的安全剂量;(2)黄芩素药理作用的实验分为正常对照组、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF β1)组、溶剂对照组、不同剂量黄芩素组,利用Western Blot检测黄芩素抑制TGF β1刺激人肺成纤维细胞株MRC-5细胞转化模型中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COL1A1),纤连蛋白(fibronectin,Fn)等的表达;(3)细胞免疫荧光法检测各实验组肺成纤维细胞中细胞肌丝形成情况;(4)实时定量PCR法检测各实验组肺成纤维细胞中miR-21表达;(5)应用脂质体转染方法在MRC-5细胞中过表达miR-21拟似物,通过检测α-SMA蛋白表达水平的变化与含肺成纤维细胞胶原胶收缩情况研究miR-21是否的确参与了黄芩素抑制肺成纤维细胞转化的作用;(6)双荧光素酶报告基因法检测miR-21转录因子AP1的活性,Western Blot检测miR-21另一转录因子STAT3活性;(7)Western Blot检测黄芩素对TGF β1刺激MRC-5细胞转化中miR-21下游靶点Spry1与Smurf2蛋白表达水平的影响;(8)应用Spry1 siRNA下调Spry1蛋白表达水平研究黄岑素抑制肺成纤维细转化作用是否与miR-21下游靶点Spry1有关。2.基于定量蛋白质组学研究黄芩素抑制肺成纤维细胞中Ⅰ型胶原合成的作用(1)Western Blot法测定黄芩素对TGF β1刺激MRC-5细胞转化模型中Ⅰ型胶原蛋白合成的影响;(2)应用稳定同位素氨基酸标记细胞培养(stable isotope labeling by amino acid in cell culture,SILAC)定量蛋白组学技术分析黄芩素抑制TGF β1刺激MRC-5细胞转化模型中Ⅰ型胶原蛋白合成中涉及的重要信号分子;(3)Western Blot测定TGF β1刺激MRC-5细胞转化模型中黄芩素对结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)的蛋白表达水平的影响;(4)实时定量PCR法测定黄芩素对CTGF mRNA水平的影响;(5)应用脂质体转染法在MRC-5细胞中过表达CTGF,研究黄芩素是否通过CTGF抑制Ⅰ型胶原合成;(6)Western Blot法检测黄芩素对CTGF的相关转录因子SP1、Smad3/p-Smad3、Smad2/p-Smad2表达水平的影响。实验结果:1.黄芩素下调miR-21抑制肺成纤维细胞转化的作用(1)细胞增殖实验检测结果发现1 μM,10 μM黄芩素对肺成纤维细胞增殖未见影响;(2)10 μM黄芩素可以显著下调TGF β1刺激MRC-5细胞转化模型中的肺成纤维细胞转化标志蛋白α-SMA和细胞外基质蛋白Ⅰ型胶原、纤连蛋白的表达,而1 μM黄芩素虽未影响α-SMA蛋白的表达水平,但对细胞外基质蛋白Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白表达呈时间依赖的抑制作用;(3)细胞免疫荧光染色结果显示10 μM黄芩素可显著抑制肺成纤维细胞转化过程中细胞肌丝的形成;(4)10 μM黄芩素可显著下调肺成纤维细胞转化过程中miR-21的表达水平;(5)miR-21拟似物可明显拮抗黄芩素抑制肺成纤维细胞转化;(6)黄芩素可以显著抑制miR-21上游转录因子STAT3的活化,而对另一个miR-21上游转录因子AP-1活性无显著影响。(7)黄芩素可以上调miR-21下游靶点Spry1蛋白的表达水平,而对其另一靶点Smurf2蛋白的表达水平则无显著影响;Spry1 siRNA可以明显拮抗黄芩素抑制肺成纤维细胞转化;2.基于定量蛋白质组学研究黄芩素抑制肺成纤维细胞中Ⅰ型胶原合成的作用(1)10 μM黄芩素可以显著下调TGF β1刺激MRC-5细胞转化模型中细胞外基质蛋白Ⅰ型胶原蛋白的表达水平;(2)通过蛋白质数据库搜索获得黄芩素组和TGF β1组中蛋白水平存在显著差异的蛋白,我们发现结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)表达显著下调,matescape数据库搜索也显示CTGF与细胞外基质形成存在关联;(3)Western Blot测定结果显示黄芩素显著下调CTGF蛋白,同时发现黄芩素可下调CTGF mRNA表达水平;(4)在TGF β1刺激MRC-5细胞转化模型中过表达CTGF则可以显著拮抗黄芩素抑制Ⅰ型胶原蛋白的生成;(5)在TGF β1刺激MRC-5细胞转化模型中黄芩素可以下调CTGF转录因子Smad2蛋白的磷酸化水平,而对SP1,磷酸化Smad3蛋白的表达水平则无显著影响;结论:(1)黄芩素可通过STAT3/miR-2 1/Spry1通路发挥抑制肺成纤维细胞转化的作用;(2)黄芩素可通过Smad2/CTGF通路发挥抑制肺成纤维细胞转化过程中细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白合成的作用;