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新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是禽类新城疫病(ND)的病原，为单股负链RNA病毒。病毒基因组编码NP、P、M、F、HN、L六种特异性结构蛋白，其中HN蛋白和F蛋白是重要的宿主保护性抗原，与病毒的致病性和毒力密切相关。HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，在病毒侵染过程中起识别细胞受体、介导病毒吸附细胞膜的作用，并在感染过程中具有促融合的作用。而F基因是决定NDV毒力强弱的主要因素。该病经过多年的防制，现已基本控制了该病的流行。近年来，我国新城疫的发生出现了新的特点，即非典型新城疫病例日益增多，高抗体鸡群发病等。许多学者认为这可能与NDV毒株变异有关。因此，开展NDV的病原研究及新型疫苗的开发显得尤为重要。本试验首先对滨州及其周边地区的6株新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)分离株进行了F基因和HN基因的克隆及序列分析，确定了其毒力强弱、进化地位及基因型，为研究新城疫分子流行病学特点和综合防制措施提供了依据。本研究成功构建了基因Ⅶ型NDV HN基因的真核及腺病毒表达载体，为研究新型NDV基因工程疫苗奠定了基础。研究内容如下: 1.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株(DZNDV/001、DZNDV/004、DZNDV/005、DZNDV/006、DZNDV/007、DZNDV/008)的F基因和HN基因进行了扩增，各扩增产物经克隆、测序后与GeneBank登陆的NDV参考毒株的F基因及HN基因进行核苷酸序列分析。结果表明，NDV分离毒株间F基因核苷酸同源性在79.6％-100％之间，并且分离毒株DZNDV/001、DZNDV/004、DZNDV/005、DZNDV/006、DZNDV/008与基因Ⅱ型参考毒株B1、Lasota、HB92、Clone30等同源性在92.9％-99.9％之间;推导其氨基酸序列分析表明，分离毒株DZNDV/001、DZNDV/004、DZNDV/005、DZNDV/006、DZNDV/008 F蛋白的裂解位点均为112GRQGRL117，具有NDV弱毒株裂解位点氨基酸组成特征，与毒力指标测定结果相符。分离毒株DZNDV/007与基因Ⅶ型参考毒株KBNP-4152、NA-1等同源性在90.6％-97.6％之间;推导其氨基酸序列分析表明，分离毒株DZNDV/007 F蛋白的裂解位点为112RRQKRF117，具有NDV强毒株裂解位点氨基酸组成特征，与毒力指标测定结果相符。NDV分离毒株间HN基因核苷酸同源性在77.2％-100％之间，并且分离毒株DZNDV/001、DZNDV/004、DZNDV/005、DZNDV/008与基因Ⅱ型参考毒株B1、Lasota、HB92、Clone30等同源性在97.1％-99.4％之间;分离毒株DZNDV/006、DZNDV/007与基因Ⅶ型参考毒株KBNP-4152、NA-1等同源性在88.9％-91.7％之间;值得注意的是DZNDV/006株HN基因与基因Ⅶ型的DZNDV/007及基因Ⅶ型参考毒株NA-1、KBNP-4152等处于同一进化分支，同源性达88.9％-91.7％，可能为基因Ⅱ型与基因Ⅶ型天然重组株，有待进一步研究。 2.设计引物分别扩增Ferritin和基因Ⅶ型NDV HN基因，并利用重叠延伸PCR将Ferritin与HN基因串联，插入真核表达载体pCI-neo中，将鉴定正确的重组质粒转染293A细胞，通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定了其正确表达。本研究首次成功地将Ferritin与NDV HN基因串联真核表达。这为研制新型NDV基因工程疫苗奠定了基础。 3.设计引物扩增基因Ⅶ型NDV HN基因，并将其插入穿梭载体pShuttle-CMV中，经pmeⅠ线性化后转化大肠杆菌BJ5183（内含pAdEasy-1骨架质粒）感受态细胞，经pacⅠ鉴定正确的阳性质粒转化至DH5α感受态细胞扩增病毒并纯化质粒，用pacⅠ完全线性化重组病毒质粒后转染于293A细胞，约7-10d左右出现细胞病变，通过PCR和Western-blot鉴定该腺病毒重组表达载体构建正确并且HN蛋白正确表达。本研究成功地利用腺病毒表达系统表达了基因Ⅶ型NDV HN蛋白，为研制NDV亚单位疫苗奠定了基础。