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第一部分壬基酚诱导睾丸支持细胞损伤及其Akt/mTOR信号调控机制目的:壬基酚(nonylphenol,NP)是一种环境内分泌干扰物,在各种环境介质中广泛存在,可诱导雄性生殖毒性。支持细胞(Sertoli cells,SCs)是曲细精管唯一体细胞,对生精细胞的增殖、分化和精子成熟有重要作用。本部分旨在研究NP对原代SCs的损伤作用及其信号调控机制。方法:原代培养睾丸SCs,使用FSHR抗体特异性标记后,利用激光共聚焦显微镜观察检测细胞纯度。根据NP暴露情况,将SCs分为对照组(0μM)和不同浓度NP染毒组(10、20、30μM);利用PI3K抑制剂wortmannin预处理1h,与NP联合干预SCs。染毒12h后,采用RT-PCR方法检测细胞Akt/mTOR信号通路、caspase-3、LC3、结构和功能蛋白基因表达情况,利用western blotting和免疫荧光检测细胞相应目标蛋白表达。结果:SCs纯度大于95%。中、高剂量组NP染毒可显著抑制SCs PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达水平,干扰该信号通路蛋白mRNA的表达;同时使p-AMPK蛋白表达增加。此外,pro-caspase-3 和 LC3B-Ⅰ 蛋白表达降低,cleaved-caspase-3、LC3B-Ⅱ蛋白表达增加,LC3B-Ⅱ/ⅠLC3B-比值升高。同时NP显著降低ABP、FSHR、N-cadherin、transferrin和vimentin蛋白表达,干扰除vimentin外的结构功能蛋白mRNA转录水平。使用Wortmannin预处理后,可减轻NP染毒SCs中PI3K和PTEN蛋白降低程度。结论:NP可诱导睾丸支持细胞凋亡和自噬发生,损伤睾丸支持细胞结构和分泌功能,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路。第二部分壬基酚对青春前期雄性大鼠的生殖毒性及机制研究目的:青春前期至性成熟期是机体生殖系统发育成熟的关键期。本文旨在研究NP暴露对此阶段SD雄性大鼠睾丸组织结构、功能,附睾精子质量的影响。方法:将42只青春前期(21天)SD雄性大鼠,随机分成六组:0、25、50、100mg/kg NP、NAC、NAC+100mg/kgNP组,每组7只。将NAC加入到大鼠饮水中,浓度为1g/l。每两天腹腔注射染毒一次,染毒15次,最后1次染毒48h后颈椎脱臼处死大鼠。采用ELESA法测定血清睾酮、FSH、LH水平,比色法检测血清SOD、MDA、GSII-PX水平,HE染色观察睾丸组织形态结构变化,TUNEL法测定睾丸组织凋亡发生,RT-PCR法检测睾丸组织目的基因表达,western blotting和免疫荧光法检测组织目的蛋白表达。结果:NP染毒降低各组血清睾酮水平,低、中、高剂量组依次降低15.58%、17.23%和13.38%。高剂量组NP可降低血清SOD水平(下降22.49%),增加MDA含量(上升 46.01%)。此外,NP 干扰 PI3K、PTEN、PDK1、p-Akt、p-mTOR、p70S6K、caspase-3、LC3B基因和或蛋白表达。NP诱导附睾精子形态异常,中、高剂量组精子畸形率分别是对照组的2.00和3.02倍;诱导睾丸组织凋亡,中、高剂量组凋亡率显著增加(分别是对照组的2.03和2.87倍)。NAC预处理后,可减少血清MDA含量,降低NP对附睾精子的损伤和睾丸凋亡水平。结论:青春前期至性成熟期NP暴露,可引起机体内分泌功能紊乱、氧化失衡,通过干扰PI3K/Akt/mTOR信号通路,诱导睾丸组织细胞凋亡和自噬,降低附睾精子质量。第三部分孕期暴露壬基酚对雄性子代生殖毒性及机制研究目的:孕期十分敏感,易受各种有害因素的影响,此时期暴露对于子代生殖系统发育成熟至关重要。孕期暴露可能造成个体成年期发生多种疾病。木文旨在研究NP孕期暴露对雄性子代青春前期、青春期和性成熟期睾丸组织结构和功能、附睾精子质量的影响。方法:将40只成年雌性SD大鼠,与雄性大鼠合笼后受孕,按照怀孕时间随机分成四组:对照组、10、50和200mg/kgNP组。于孕14～20天根据孕鼠体重每天进行灌胃染毒;分别在产后21天、35天和60天,在各组随机挑选6只雄性仔鼠(各时间点均24只)进行试验。颈椎脱臼处死仔鼠后,采用ELESA法测定血清睾酮、FSH、LH水平,HE染色观察睾丸组织形态结构变化,TUNEL法测定睾丸组织凋亡发生,透射电镜观察组织内各细胞超微结构改变,RT-PCR检测睾丸组织目的基因表达,western blotting和免疫荧光检测组织目的蛋白表达,计算机辅助精液分析系统分析60日龄大鼠附睾精子质量。结果:孕期NP暴露,60日龄雄性仔鼠低、高剂量组的体重和睾丸重量明显降低;35日龄仔鼠低剂量组睾丸重量减少;21日龄仔鼠低剂量组睾丸重量和脏器系数显著降低。NP孕期染毒可干扰不同发育阶段雄性仔鼠睾酮、FSH、LH水平;引起睾丸组织形态结构改变,诱导凋亡和自噬发生增加;同时NP抑制Akt/mTOR信号通路基因和蛋白水平表达,干扰组织中结构和分泌功能蛋白表达。此外，NP诱导附睾精子畸形率升高,降低精子密度和质量。35 日龄雄性仔鼠睾丸组织凋亡发生率明显高于其他时间段。结论:孕期NP暴露导致雄性子代内分泌功能紊乱,抑制Akt/mTOR信号通路,诱导睾丸组织细胞凋亡和自噬,破坏睾丸组织结构和功能,降低性成熟期附睾精子质量,造成生殖损伤;青春期雄性子代睾丸组织凋亡较明显。