香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA4编码区基因的克隆及原核表达

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香蕉是世界最主要的五大水果之一,在世界贸易中占重要地位。由香蕉束顶病毒(Banana Bunchy top vires,BBTV)引起的香蕉束顶病(Banana Bunchy topdisease,BBTD)是香蕉上的头号病害,其流行具有巨大的毁灭性。因此,香蕉束顶病毒的分子生物学研究早在20世纪80年代受到了极大的重视。BBTV是一种双链DNA病毒(ssRNA),其基因组共有6个组分,分别为BBTVDNA1、2、3、4、5、6。推测组分4编码BBTV的跨膜运动蛋白,但其在整体植株的上功能尚未被证明。 本研究的目的是克隆BBTV DNA4的编码区基因,并对其进行原核表达,获得其原核表达产物,制备其特异的抗血清,为通过遗传互补实证实BBTV DNA4编码蛋白在整体植株上的功能提供必要的证据。 利用PCR方法克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物(banana bunchy topvires Chinese Zhangzhou,BBTV-ZZ)DNA 4编码区。序列分析结果表明该编码区由351个核苷酸组成,推测其编码一个含116个氨基酸的蛋白质(M.W.14.5kD)。将BBTV DNA4编码区克隆到一系列原核表达载体(PBV221、pET30a、pET28a、pQE、pGE、pTYB2、pTrcHisA)上,得到重组质粒。在原核表达载体pTYB2上,构建了该基因的融合表达载体pTYB-B4,SDS-PAGE分析表明,69kD的融合蛋白在大肠杆菌ER2566(DE3)中正确表达。以含有表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了BBTV DNA4编码蛋白的特异抗血清。Western blot显示:以所得到的69kD的融合蛋白为抗原免疫家兔,得到了既能和原核表达产物69kD的融合蛋白发生特异免疫反应又能与Southern bolt分析为阳性的转BBTVDNA4编码区烟草中14.5kD的蛋白发生特异免疫反应的抗血清。 本实验为研究BBTVDNA4编码蛋白在整体植株上的功能奠定了基础,并通过对系列E.coil表达载体的实验,较详尽的探讨了影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素。
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