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结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，循证医学得出，全球范围内结直肠癌的发病率处于恶性肿瘤的第三位，每年约有120万例新增患者。全身化疗临床使用受到较多关注，其目的是通过全身或局部作用，达到消灭或抑制病患体内的残余病灶、微转移灶，提高临床治愈机率，以延长患者中位生存期，最终实现生活质量改善。分子靶向治疗药物的开发及应用，使晚期大肠肿瘤的治疗获益，进一步推进了结直肠癌肿瘤综合治疗的发展。对肿瘤分子靶向治疗的研究已成为当前的热点,针对这些分子事件作为靶点，大量与肿瘤信号传导通路中的激酶相关的拮抗剂正在进行研究中。其中，关于CDK抑制剂的研究已成为新型抗肿瘤药物的研究热点。临床前研究显示出了与细胞周期和CDK相应的生理作用。在不同类型癌症中，cyclin D-CDK4和cyclin-CDK6复合体通过Rb磷酸化驱动细胞周期通过G1-S过渡。因此针对G1期激酶的靶向治疗药物被产生。其中，CDK4、CDK6选择性抑制剂PD-0332991，已经通过抗癌安全测试和I/II期临床测试。目前，没有研究关于这种抑制剂在大肠癌治疗中的治疗潜力，同样，也少有研究关注于细胞周期通路在大肠癌中的应用。临床前和临床研究已经表明PD-0332991的抗癌活性，它作为选择性细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂，在不同肿瘤治疗中具有视网膜细胞瘤蛋白（Rb依赖性。目前还不清楚在结直肠癌，CDK4、CDK6或两者是否都需要Rb磷酸化，因此PD-0332991可用于针对这个CDK-Rb轴的癌症治疗。SUMO蛋白被广泛表达在整个真核生物界，在体内，SUMO化可能会影响靶蛋白在稳定、定位或激活的任何一个方面。SUMO蛋白作用广泛，参与细胞活动的各个阶段，目前已知包括细胞的有丝分裂、生长、分化、衰老及凋亡过程。研究表明，SUMO修饰途径在肿瘤发生、发展中起到重要作用。UBC9水平的增加在许多人类癌症中被发现，并且UBC9过表达能增加癌细胞生长。SUMO的E3蛋白PIAS3（活化的STAT3蛋白抑制剂）在许多不同的癌症类型被上调，SUMO E1酶水平升高与降低与肝细胞癌患者存活率相关。此外，SUMO化能参与并调节重要的肿瘤抑制蛋白。第一部分：PD-0332991通过CDK6-RB轴抑制结直肠癌生长机制研究目的：研究大肠癌组织及细胞系中CDK4、CDK6、Rb等表达情况，明确CDK4、CDK6在大肠癌细胞周期调节中的作用，检验PD-0332991在大肠癌细胞中的抑制作用并研究作用机制。方法：采用酸性磷酸酶法测定细胞生长抑制率，PI染色细胞周期检测，组织总蛋白提取，蛋白电泳及Western Blot检测，慢病毒转染及RNAi技术，shRNA细胞稳定转染等实验技术和方法。结果：本研究表明，大肠癌组织及其匹配的正常结直肠组织比较，G1期CyclinD1，D2，D3，CDK4，CDK6和pRB蛋白在大肠癌组织高表达，CDK4和CDK6控制细胞周期G1-S转变；CDK6敲除，而不是CDK4敲除，明显减少Rb磷酸化，抑制结直肠癌细胞生长。因此，CDK6起着Rb磷酸化和肿瘤生长的关键作用。在结直肠癌细胞中， PD-0332991通过G1期阻滞，诱导阻断Rb磷酸化，抑制细胞的生长。第一次表明CDK6-Rb轴在癌症生长中至关重要，由于可实现CDK6-RB轴的靶向定位，PD-0332991可能被证明是用于治疗结肠直肠癌的新型药物。第二部分：SUMO1参与结直肠癌中CDK6-RB通路的修饰。目的：研究大肠癌细胞系中SUMO1蛋白表达情况，明确并验证SUMO1参与大肠癌细胞周期蛋白的修饰，并探讨及作用机制。方法：采用酸性磷酸酶法细胞活力测定，PI染色细胞周期检测，蛋白电泳及Western Blot检测，慢病毒转染及shRNA细胞稳定转染，免疫沉淀IP等实验技术和方法。结果：研究表明，在大肠癌细胞中SUMO1通路被激活，SUMO1在大肠癌组织过度表达，SUMO1敲除抑制了大肠癌的细胞周期进程和肿瘤生长，细胞周期同步化16小时后，肿瘤细胞进入S期时间明显延长，IP表明CDK6被2种SUMO1单体修饰，CDK6的SUMO化稳定蛋白质，从而维持磷酸化Rb的酶激活。因此，我们在大肠癌细胞研究的前期工作中，初步建立了CDK6-SUMO1调控的细胞周期通路。CDK6-SUMO1-Rb通路的生物学功能使得它可能成为肿瘤分子靶向治疗的一个理想新靶标，并有可能在此基础上进一步发展为高效、特异及低毒的抗肿瘤药物。结论：通过本课题的研究，结直肠癌组织与癌旁正常组织对比，SUMO1，CDK6，CDK4高表达，SUMO1，CDK6，CDK4在结直肠癌细胞系中高表达；PD-0332991通过CDK6-Rb通路的抑制达到结直肠癌中的治疗有效性，PD0332991阻断Rb磷酸化，诱导G1逃逸，进而抑制大肠肿瘤细胞生长；大肠癌细胞COLO320中CDK6被2种SUMO1修饰，SUMO1参与大肠癌细胞COLO320中CDK6-RB通路的修饰调节；SUMO1、CDK6shRNA敲除明显抑制大肠癌COLO320细胞生长，且SUMO1与CDK6分别敲除后细胞生长曲线一致。