尽管许多组织中存在干细胞,但由于其数量相对稀少,且与组织中的其它细胞无显著性的差别,很难清楚地区分它们。因此,在各种不同的组织中如何科学的分离出这些数量稀少的干细胞,解决目前研究中存在的所用细胞纯度低、难以建立体外高纯度、高活力的细胞库等问题,是干细胞研究人员所亟待解决的[1]。皮肤组织有着很强的再生能力,表皮基底层中的干细胞终身不断自我更新、持续分化以取代终末分化细胞,从而进行组织结构的更新。终末分化细胞的死亡、脱落与基底干细胞的分裂维持一定的平衡,这是维持正常的表皮组织结构和细胞内环境稳定的基本要求[2]。随着分子生物学、细胞生物学、组织工程学及生物工程学等学科的发展,表皮干细胞凭借其特有的生物学优势在基因治疗、细胞治疗中越来越受到重视,成功地分离、培养表皮干细胞对临床上创伤修复、皮肤癌的研究也起着至关重要的作用[3-9]。但是由于在表皮干细胞的特异性分子标志、识别标准、分布定位及体外培养条件下生物学行为的变化等诸多方面都还存在争议,限制了表皮干细胞的基础研究与临床应用。目前,表皮干细胞的分选主要有两种方法,利用表皮干细胞对IV型胶原的快速黏附能力进行筛选[10];或利用表面标志物用流式细胞仪进行筛选[11]。前者方法简单易行,但分选的精度较低,后者分选的精度较大,阳性率高,但分选后细胞活性会受到影响,且成本较高,在国内研究很难得以推广应用。免疫磁珠分选(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)技术是一种集合了免疫学、细胞生物学、磁力学等知识于一体的高度特异性细胞分选技术,MACS微珠小,直径约50nm,体积约为细胞的百万分之一,与流式细胞仪兼容,分选后细胞可用流式分析;MACS微珠由氧化铁和多聚糖组成,易降解,对细胞无毒性;目前,MACS技术在血液系统方面得到广泛应用[12]。皮肤是人体面积最大的器官,也是机体面对外界的第一道屏障。表皮干细胞在维持皮肤的自我更新、创伤修复,皮肤肿瘤的发生等方面扮演着重要的角色。在表皮干细胞的研究当中,国内外学者主要以人或小鼠为研究对象,而对大鼠的研究较少;本课题以大鼠为研究对象,探讨表皮干细胞体外分离培养、定位和鉴定的方法。主要研究方法和结果如下:1.大鼠表皮干细胞的组织定位采用免疫组织化学技术,表皮基底层、毛囊外根鞘区用α6-integrin、β1-integrin、K15等表皮干细胞干细胞标记物染色阳性,而分化指标CD71、K10在表皮基底层上各层表达阳性;CD34在表皮基底层阴性表达,而在毛囊隆突区阳性表达。表明在表皮基底层、毛囊外根鞘区存在干细胞。CD34被认为是毛囊外根鞘隆突区最好的干细胞标记物之一[13],本实验中,在大鼠背皮基底层未见CD34的表达,由此推测表皮基底层的干细胞和位于毛囊隆突区的干细胞可能存在生物学方面的差异。利用表皮干细胞对IV型胶原的快速黏附对细胞进行筛选,筛选出的干细胞在IV型胶原上生长良好,细胞形态均一,呈铺路石状,细胞小而圆,核浆比例大,表现出原始细胞形态的特征,具有较高的克隆形成率,干细胞标记物K15、β1-integrin、α6-integrin阳性表达,而分化标记物CD71、K10表达较弱或呈阴性。说明较为成功的培养出大鼠表皮基底层干细胞。2.大鼠表皮干细胞的VarioMACS分离技术的建立首次利用VarioMACS技术分离大鼠表皮基底层表皮干细胞,选择CD71去除分选后再α6-integrin阳性分选。分选效率8.62/1,扫描电镜可见分选出来的α6briCD71dim细胞呈圆形或椭圆形,形态规则,细胞表面见突起,细胞表面黏附有数量不等的圆形磁珠(直径为50nm左右)。3. VarioMACS分选大鼠表皮干细胞的生物学特性VarioMACS分选的大鼠表皮干细胞总体生长缓慢,细胞存活率相对较低,体外用K-SFM培养,免疫组织化学检测K15、β1-integrin、α6-integrin阳性表达,而分化标记物CD71、K10表达较弱或呈阴性。IPP软件分析表明VarioMACS分选的细胞和Ⅳ型胶原筛选细胞的平均光密度(AOD)值有显著性差异(P<0.05),表明VarioMACS分选的表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)具有较好的干细胞性。用10%FBS的DMEM进行诱导分化培养,可见培养的细胞形态偏大,呈多角形,后期有分层现象,K10表达为阳性,而干细胞标记物α6-integrin、β1-integrin、K15表达为阴性,表明VarioMACS分选的ESCs有一定的分化潜能。本实验成功的培养出大鼠表皮干细胞,并首次利用VarioMACS技术分离出大鼠表皮干细胞。为表皮干细胞的体外分离开辟了一个新的途径,也为表皮干细胞的免疫磁珠分选提供了一个技术平台。