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目的:治疗冠心病在终末期可以采用细胞替代性血管新生,此种方法已经受到的广泛关注。其治疗原理就是希望使缺血区的小血管再生增多以及侧枝循环形成以得到充分的血液供应。然而,目前的血管发育研究对参与血管发生的细胞因子、受体以及相关的信号转导分子的了解还十分局限,参与血管发生的重要调控因子仍有待实验研究来发现。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是可以在体外正常培养条件下进行了无限性的传代增殖的多能性细胞系。ESC可以自发形成具有内、中、外三胚层结构的胚胎小体(embryoid bodies,EBs)在培养条件适合的情况下,并能分化形成卵黄囊样血管网结构以模拟体内早期胚胎血管发生过程,可以说,ESC是研究早期血管发育的最经典的模型。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A- stimulated genes,CREG)是一种新的转录调控相关因子。它可以抑制细胞增殖,促进细胞分化。我室前期研究发现,CREG不仅可以作为维持成熟血管平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)分化表型的重要调控分子之一。还可以在胚胎发育早期的单层血管内皮细胞(endothelium cells,EC)中表达,并一直持续至血管成熟。上述研究提示:CREG是参与细胞分化外和调控胚胎早期血管发生的重要调控因子。为阐明CREG在胚胎早期血管发生中表达的意义,本研究以体外培养的小鼠ESC-R1为对象,逆转录病毒为载体,制备CREG基因过表达和表达沉默的ESC,观察CREG表达对ESC分化及血管发生的影响。方法:1 .应用pCXN2-FLAG-CREG-IRES-EGFP、pDS-shRNA-CREG和pDS- shRNA-GFP逆转录病毒真核表达载体,感染小鼠ESC-R1,筛选获得稳定的ESC克隆(分别命名为R1-wtCREG、R1-shCREG和R1-GFP);用小鼠胚胎成纤维细胞株(STO)作为饲养细胞,进行R1、R1-wtCREG、R1-GFP和R1-shCREG培养,倒置显微镜观察四种ESC的生长情况。2.当ESC生长至亚融合状态时,去除LIF悬浮培养制备EBs。倒置相差显微镜下观察不同发育时间点,R1/EBs、R1-wtCREG/EBs和R1-shCREG/EBs的分化情况。3.收集悬浮培养5.5天的R1/EBs和R1-wtCREG/EBs,制备冰冻切片。免疫荧光染色观察内胚层标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)和基底膜标志物层粘连蛋白(Laminin,LN)分化情况。4.选取悬浮培养3天且形态发育良好的R1/EBs和R1-wtCREG/EBs,移植入Matrix胶中继续培养7天后,DiI-Ac-LDL染色观察ECs的分化情况。5.Western-blot方法检测R1/EBs、R1-wtCREG/EBs和R1-shCREG /EBs中CREG、VEGF及Flk-1的蛋白表达;向R1-shCREG /EBs培养基中添加10μl/mL的重组CREG蛋白或者向R1-wtCREG/EBs培养基中添加15 ng/mL antiVEGF后,观察细胞的分化情况和VEGF和Flk-1蛋白的表达变化。6 .定量RT-PCR和Western-blot分别检测R1/EBs、R1-GFP/EBs和R1-shCREG/EBs中CREG表达;应用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色和小鼠心肌荷瘤实验检测pDS-shRNA-CREG感染后ESC的干性和全能分化能力是否发生改变。7 . Annexin V/PI流式细胞分析方法检测R1/EBs、R1-GFP/EBs和R1-shCREG/EBs凋亡情况;定量RT-PCR和Western-blot分别检测上述三组EBs细胞中cleaved caspase-3 mRNA和蛋白的表达。结果:1.经pCXN2-FLAG-CREG-IRES-EGFP、pDS-shRNA-CREG和pDS- shRNA-GFP逆转录病毒真核表达载体感染后,R1、R1-wtCREG和R1-shCREG的细胞进行EBs培养,行Western Blot检测证明筛选成功(实验室已证实)。各感染组干细胞在体外培养条件下生长良好。2.倒置相差显微镜观察发现,悬浮培养的R1-wtCREG/EBs较R1/EBs更易分化。悬浮培养7天后,大部分R1-wtCREG/EBs已发育成卵黄囊血管网结构,正常小鼠R1/EBs要悬浮培养12~14天才可发育形成卵黄囊血管网结构,而R1-shCREG/EBs生长缓慢、未见胚层分化现象、细胞培养基中代谢废物和细胞碎片较多。3.收集悬浮培养第5.5天的各组EBs,制备冰冻切片行免疫荧光染色观察发现,R1-wtCREG/EBs形成的LN及AFP较R1/EBs完整、界限清晰,而R1-shCREG /EBs组染色未见基底膜和内胚层形成。4.DiI-Ac-LDL活细胞内吞荧光染色发现,R1-wtCREG/EBs分化形成的ECs主要集中在EBs爬伸细胞的外缘,数目较多;而R1/EBs分化形成的ECs在EBs周边呈散在分布。5.Western-blot检测发现,R1-wtCREG中VEGF表达较R1/EBs明显增高,而R1-shCREG/EBs中几乎无VEGF表达;悬浮培养5.5天后,R1-wtCREG/EBs中CREG、VEGF和Flk-1蛋白表达均比R1/EBs显著增多;外源性添加10μl/mL的重组CREG蛋白培养7天后,R1-shCREG /EBs组细胞出现胚层分化现象,同时Flk-1蛋白表达明显增多;相反,在悬浮2天的R1-wtCREG/EBs培养基中添加15ng/mL的anti-VEGF中和抗体阻断VEGF表达后,细胞血管形成现象被抑制,同时Flk-1表达明显减少。6.定量RT-PCR和Western blot检测发现,悬浮培养7天的R1- shCREG/EBs中CREG的mRNA和蛋白表达较R1/EBs组和R1-GFP/EBs组均显著降低。AKP染色证实,R1-GFP、R1-shCREG和R1三组ESC干性较好。小鼠心肌荷瘤实验证实,R1和R1-GFP组细胞具有三胚层分化能力,在心肌内形成畸胎瘤组织;而R1-shCREG细胞注射组未见畸胎瘤组织出现,提示细胞分化受到抑制。7.Annexin V/PI流式双荧光染色证实,悬浮培养7天R1-shCREG/EBs细胞的凋亡率较R1/EBs组和R1-GFP/EBs明显升高;RT-PCR和Western blot证实R1-shCREG/EBs中cleaved caspase-3在mRNA和蛋白水平表达显著升高。结论:1. CREG过表达通过调控VEGF/Flk-1表达促进ESC来源的EBs中血管ECs的分化和卵黄囊血管网发生,提示CREG可能是胚胎发育早期血管发生的重要调控因子。2.沉默CREG表达抑制ESC的分化,诱导EBs发生自发性凋亡。