研究背景据WHO统计,每年新增癌症病人约1000万。随着医疗技术的不断提高,癌症患者5年生存率亦有显著升高,由过去的30%增至64%。由此带来的问题是骨癌痛患者的增加。所谓的骨癌痛是指原发性或转移性骨肿瘤引起的慢性疼痛。据统计,70%的骨肿瘤患者伴有不同程度的疼痛,然而,由于目前对骨癌痛发病机制还认识不清,临床尚缺乏有效的治疗方法。传统的治疗方法如三阶梯治疗,不但治疗效果有限,而且副作用严重。目前临床大多数晚期骨癌痛患者遭受疼痛的折磨,生存质量低下。如何有效治疗骨癌痛,对于改善肿瘤患者的生存质量,具有重要的临床意义。因此,探究骨癌痛的发病机制,寻找有效的治疗方法是目前癌症病人治疗面临的重要课题。脊髓背角是疼痛形成的初级中枢,众多研究已表明,脊髓背角的中枢敏化在骨癌痛的产生和形成过程中起着重要作用。外周伤害性信息首先传递到脊髓背角,在此汇聚和整合后再向上传递,最后形成痛觉。但是,有研究表明,脊髓背角对伤害性信息的传递受到脊髓上中枢如延髓、前扣带皮层(ACC)等调控。这种调控又分为下行性抑制和易化两种,这在疼痛的形成中同样起着重要作用。研究脊髓上中枢如何调控脊髓活动成为近来疼痛研究领域的热点。前扣带皮层是边缘系统的重要结构,可接受来自丘脑的纤维传入,例如前内侧丘脑核、中央下核等。这些丘脑核团大都接受来自脊髓的伤害性信息传入。因此脊髓的伤害性信息通过丘脑可传入ACC。在ACC放置记录电极,截断下肢可引起ACC产生兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents, EPSCs)。ACC不但接受外界的信息传入,还输出信号影响调节其它核团的功能。例如将实施刺激的对侧足截断,结果正常足上刺激引起的反应加强。这提示前扣带皮层吻侧部(rACC)神经元的可塑性改变在疼痛中起着重要作用。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导神经元的可塑性变化,在前脑主要以NMDA 2B受体(NR2B)形式存在。这些研究提示,rACC神经元的NR2B可能在骨癌痛的形成中起到重要作用。本课题采用疼痛行为学、免疫组织化学及分子生物学等方法探讨rACC神经元NR2B亚基参与骨癌痛形成的分子机制并为临床骨癌痛治疗提供实验依据。第一部分 骨癌痛大鼠前扣带皮层吻侧部神经元NR2B亚基表达的变化目的观察骨癌痛大鼠rACC脑区NR2B亚基的表达水平。方法成年Sprague Dawley (SD)大鼠,雌雄不拘,体重200-250g,采取随机数字表随机分为空白对照组(Naive组),假手术组(Sham组)及骨癌痛组(Tumor-bearing组)。Tumor-bearing组胫骨上段骨髓腔接种MADB-106大鼠乳腺癌细胞悬液10μl(细胞密度约5×106／m1),而Sham组注射同等剂量的生理盐水。术前及术后21天内每隔3天,测定大鼠机械痛阈值和热痛潜伏期以观察大鼠痛行为的改变。根据痛行为学的改变,选取痛行为改变最明显的4只大鼠,采用免疫组化技术和免疫印迹技术检测rACC神经元NR2B亚基的表达水平。结果机械痛阈值及热痛潜伏期三组间差异无统计学意义(P>0.05),而从术后第3天开始Tumor-bearing组机械缩爪阈值及热痛潜伏期明显降低,与Naive组和Sham组比较降低,差异有统计学意义(P<0.05)。术后14天下降最显著,至术后21天仍显著低于对照组。这提示大鼠出现明显痛觉过敏,模型复制成功。免疫荧光显示,术后14天大鼠rACC神经元NR2B阳性的数目,Tumor-bearing组显著高于Naive组和sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。采取术后14天的大鼠rACC脑组织以Western blot分析显示,Tumor-bearing组大鼠术后14天rACC神经元NR2B表达水平较术前明显升高,与对照组比较也显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胫骨髓腔内注射MADB-106大鼠乳腺癌细胞14天成功复制大鼠骨癌痛模型,同时伴随NR2B亚基的高表达。第二部分rACC内注射NR2B拮抗剂Ifenprodil对骨癌痛大鼠机械痛域和热痛潜伏期的影响目的第一部分研究结果表明,骨癌痛引起rACC神经元NR2B亚基的表达升高,rACC内给予NR2B拮抗剂是否减轻骨癌痛?因此,本部分观察rACC内注射Ifenprodil对骨癌痛机械痛域和热痛潜伏期的影响。方法根据Paxinos and watson脑定位图谱定位rACC的位置(前囟前1.7mm,旁开0.6mm,深2.5mm),埋管。术后观察7天,无异常大鼠采用胫骨髓腔注射MADB-106大鼠乳腺癌细胞复制骨癌痛模型。骨癌痛大鼠大随机分为五组：Naive组,BCP组,BCP+NS组,BCP+Ifenprodil组,BCP+CNQX组。BCP+Ifenprodil组左右两侧rACC给予Ifenprodil 0.6μl (0.2g/L),而对照组给予同等剂量的生理盐水或CNQX。测定给药前后骨癌痛大鼠的机械痛阈值,和热痛潜伏期。痛行为学测试完毕后,采用免疫组化法检测脊髓背角C-fos神经元的表达。结果给药前Naive组,BCP组,BCP+NS组,BCP+Ifenprodil组,BCP+CNQX,五组机械痛阈值和热痛潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)。注射Ifenprodil后胫骨癌痛大鼠的机械痛阈值和热痛潜伏期,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化显示,脊髓背角C-fos的表达BCP+Ifenprodil组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨癌痛大鼠rACC脑区给予NR2B拮抗剂Ifenprodil减轻大鼠的痛敏,并减少脊髓背角C-fos神经元的表达。第三部分重组慢病毒载体shRNA/NR2B (LV-GluN2B)的构建及抑制NR2B效率的检测目的尽管rACC内给予Ifenprodil可减轻骨癌痛,但是Ifenprodil镇痛作用不但时间短暂而且具有副作用,因此寻找一种镇痛时间长且安全有效的镇痛措施是目前临床所急需的。小RNA技术选择性沉默目的基因的表达已成为一种成熟的方法,选择性沉默rACC神经元NR2B亚基的表达可实现长期镇痛。因此,本研究拟构造siRNA/NR2B重组慢病毒载体以期实现此目的。方法根据基因库中大鼠NR2B亚基的mRNA序列及shRNA序列的设计原则,设计3条19nt的靶序列,进一步合成含有互补链的DNA。将此DNA插入到pFU-GW-iRNA载体质粒H1启动子的下游,进而获得3个含有shRNA/NR2B的重组质粒pFU-GW-iRNA/NR2B。同时构建一个阴性对照质粒。将合成的3个重组质粒和NR2B表达质粒共转染293T细胞,以Western blot检测目的蛋白NR2B的表达,进而确定沉默效率最高的重组质粒。再将该质粒转染293T细胞,即包装含有shRNA/NR2B重组慢病毒即LV-GluN2B。结果聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)产物经电泳分析,构建的重组质粒含有341bp大小的条带即NR2B-RNAi。结合测序结果表明,重组质粒构建成功。Western blot结果表明,Plv-NR2B3对目的基因NR2B敲减效率最高。通过转染293T细胞,最终合成可有效沉默目的基因NR2B的重组慢病毒LV-GluN2B。结论重组NR2B-RNAi慢病毒LV-GluN2B构建成功。第四部分选择性下调rACC神经元NR2B基因的表达对骨癌痛大鼠痛觉的影响目的首先建立大鼠骨癌痛模型,采用脑立体定位技术rACC内注射shRNA/NR2B重组慢病毒,通过下调rACC神经元NR2B亚基的表达水平观察下调NR2B对大鼠骨癌痛的治疗作用。方法胫骨癌痛大鼠rACC埋管后按照数字表随机分为三组：即生理盐水组、LV-NC组及LV-GluN2B组,每组8只。采用疼痛测定仪分别测量给药前,及给药后每隔3天大鼠的机械痛阂值,以及热痛潜伏期。在痛行为学效果最显著时间点取大鼠rACC脑组织,采用免疫组化,PCR及Western blot方法检测LV-GluN2B对NR2B基因的敲减效率。结果给药前三组之间的机械痛阂值和热痛潜伏期差异无统计意义(P>0.05),而rACC内给予LV-GluN2B后骨癌痛大鼠的机械痛阈值和热痛潜伏期均显著升高,与生理盐水组和LV-NC组比较,显著升高,(P<0.05)。而生理盐水组和LV-NC组与给药前比较差异无统计学意义(P>0.05)。WB和PCR结果表明,LV-GluN2B组rACC神经元NR2B蛋白和NR2BmRNA表达水平均低于对照组(P<0.05)。结论rACC内给予重组慢病毒LV-GluN2B通过下调NR2B的表达减轻骨癌痛。研究意义本研究首先采用痛行为学和分子生物学方法,观察到骨癌痛可导致rACC神经元NR2B表达水平的上调,进一步通过注射NR2B阻断剂Ifenprodil发现可减轻骨癌痛,提示rACC神经元NR2B在骨癌痛的产生和形成中起到重要作用。在此基础上,为了实现镇痛的长期性、有效性及安全性,构建了NR2B-RNAi重组慢病毒(LV-GluN2B),实现了高选择性下调rACC神经元NR2B的表达治疗骨癌痛,为临床骨癌痛的治疗提供了有力的实验依据。