背景和目的:随着经济建设的飞速发展和人们生活水平的大幅度提高,肥胖症、胰岛素抵抗、糖尿病等糖代谢紊乱性疾病发病率日益升高,已严重威胁人类健康.骨骼肌是胰岛素作用的三大靶器官之一,是机体摄取、利用葡萄糖最主要的组织,它消耗了机体80%-90%的葡萄糖,对维持全身糖代谢平衡和胰岛素敏感性具有重要意义.骨骼肌纤维主要分为两种类型,1型纤维线粒体含量丰富,主要通过氧化磷酸化提供能量,比如比目鱼肌(soleus,SOL);2型纤维线粒体含量较少,主要通过糖酵解产生ATP,比如趾长伸肌(extebsor digitorum longus,EDL).线粒体是真核细胞产生能量的主要场所,骨骼肌线粒体可通过氧化磷酸化将摄取的葡萄糖转化为ATP,不仅满足自身收缩运动的能量需求,而且对维持全身血糖平衡发挥重要作用,因此,骨骼肌线粒体功能障碍是导致其收缩功能异常和全身胰岛素抵抗的重要因素.运动与限食是一种较为健康的生活方式,为胰岛素抵抗和轻度糖尿病的基础治疗手段;运动与限食可促进骨骼肌线粒体生物合成及ATP生成,但具体机制尚不完全清楚.近年研究显示一氧化氮(NO)在线粒体生物合成及功能调节中也发挥重要作用,它可能通过cGMP活化AMP激活的蛋白激酶(AMPK),再激活调节线粒体生物合成的重要转录因子——过氧化物酶增殖体受体γ辅激活因子1α(PGC-1α),进而启动一系列调控过程,促进线粒体生物合成.非对称性二甲基精氨酸(ADMA)是一种内源性的一氧化氮合酶(NOS)抑制物,由于其结构与L-精氨酸相似,因此,可以竞争性抑制NO生成;大量研究表明,ADMA与胰岛素抵抗、糖尿病及其心血管并发症密切相关,我室前期研究发现,ADMA能抑制肝脏、心脏线粒体生物合成,并减少组织ATP含量,最近又发现ADMA抑制大鼠左心室乳头肌的收缩功能;此外,有文献报道,运动和限食可以降低机体内源性ADMA水平;但尚不知体内ADMA水平的变化是否与运动、限食调节骨骼肌收缩和骨骼肌线粒体功能有关.依据NO和ADMA在线粒体生物合成重要作用以及运动、限食对骨骼肌线粒体生物合成和内源性ADMA调节作用;故提出"运动、限食可能通过影响内源性ADMA水平及其相关通路发挥对骨骼肌线粒体功能或生物合成的调节作用,从而导致骨骼肌收缩功能改变"的科研假说.本课题拟在运动、限食16w大鼠模型,并以二甲双胍和白藜芦醇作为运动和限食的阳性对照药物,观察运动和限食对骨骼肌收缩功能和线粒体功能的影响,旨在明确运动、限食对骨骼肌收缩和线粒体功能的影响与内源性ADMA水平变化的关系,进一步阐明糖尿病时骨骼肌线粒体功能障碍的可能机制和内源性ADMA升高的病理生理作用,为相关疾病的临床防治及其新药研发提供启示.　　方法:采用跑步和限制饮食方式制备16w大鼠模型,将8周龄健康雄性SD大鼠,随机分成以下各组:(1)正常对照组(Control);(2)跑步组(Running):首先以15m/min的速度跑15min,再以20m/min的速度跑60min,最后以15m/min的速度跑15min,每周跑5天;(3)限食组(Calorie restriction,CR):每天称量正常对照组大鼠的体重和摄食量,并计算限食组摄食量=对照组摄食量/对照组体重×限食组体重×60%;(4)白藜芦醇组(Resveratrol,RSV):每天灌胃给予(50mg/kg/day);(5)二甲双胍组(Metformin,Met):每天灌胃给药(50mg/kg/day).上述各组大鼠在造模结束前3天进行口服糖耐量试验(OGTT)测定;造模结束时,麻醉处死大鼠,迅速分离比目鱼肌和趾长伸肌,经充氧、预冷的K-Hensleit缓冲液冲洗后,固定于组织浴槽连接张力换能器和实验数据处理系统,采用电刺激法检测两种肌肉的单次收缩、强直收缩和疲劳收缩的张力变化;实验结束后拭干肌肉上的水分,测长度,称肌重,将其冻于-80℃冰箱留做后续实验待用.应用PCR和RT-PCR技术检测比目鱼肌和趾长伸肌中线粒体基因细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)与核基因β-actin的拷贝数,以及线粒体上游调控因子PGC-1α、核呼吸因子NRF和解偶联蛋白UCP2的基因转录水平以反映线粒体生物合成及调节;采用Western blot法检测比目鱼肌和趾长伸肌中AMPK、PGC-1α、内源性ADMA产生酶PRMT1、ADMA代谢酶DDAH和NOS的表达;应用HPLC法检测血清中ADMA的含量;使用荧光素酶法检测比目鱼肌和趾长伸肌中ATP含量以反映线粒体功能;用比色法检测骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)活性、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量以及DDAH、NOS活性与NO水平.　　结果:(1)与正常对照组比较,跑步组和限食组大鼠口服糖耐量试验的血糖-时间曲线下面积显著减少(P<0.05),提示长期运动与限食可改善胰岛素敏感性;(2)跑步组、限食组和白藜芦醇组大鼠比目鱼肌单次收缩和强直收缩的最大张力明显高于正常对照组(P<0.05),只有限食处理才使大鼠趾长伸肌单次收缩和强直收缩的最大张力明显提高(P<0.05),提示长期的运动和限食可增强骨骼肌收缩功能;(3)与正常对照组比较,无论是跑步和限食干预,还是RSV和Met药物处理,均增加大鼠比目鱼肌中线粒体基因COXⅠ与核基因β-actin拷贝数的比值和PGC-1α、NRF等基因转录水平(P<0.05),但对趾长伸肌中这些基因的表达无明显影响,提示长期运动和限食明显增加骨骼肌线粒体生物合成;(4)跑步和限食干预16w使大鼠比目鱼肌的ATP水平明显高于正常对照组(P<0.01),跑步16周还增加大鼠趾长伸肌中的ATP含量(P<0.05),提示长期运动和限食增加骨骼肌线粒体功能,尤其以运动更明显;(5)跑步组、限食组以及RSV组和Met处理16w均显著降低大鼠血清内源性ADMA浓度(P<0.05),明显升高骨骼肌中NO含量(P<0.05),运动、限食干预还增加骨骼肌NOS活性,此外,运动干预可增加比目鱼肌中内源性ADMA的主要降解酶DDAH2蛋白表达,限食干预则使比目鱼肌中内源性ADMA主要生成酶PRMT1的蛋白表达下调;提示这些蛋白表达及酶活性的改变是导致上述行为干预和药物处理降低内源性ADMA含量的重要机制;(6)运动、限食干预以及RSV和Met处理均可增加骨骼肌中SOD活性,降低MDA含量,提示以上处理降低骨骼肌组织的氧化应激.　　结论:(1)长期运动和限食增加大鼠胰岛素敏感性;　　(2)长期运动和限食均可增强大鼠骨骼肌收缩功能,尤以限食的效果更明显;　　(3)长期运动和限食干预以及白藜芦醇和二甲双胍处理均可促进骨骼肌线粒体线粒体生物合成、增加ATP含量、降低氧化应激,这些可能与运动和限食增强骨骼肌收缩功能有关;　　(4)长期运动和限食干预以及白藜芦醇和二甲双胍处理明显降低内源性ADMA浓度、使NOS活性升高、NO含量增加,这些可能与运动、限食下调ADMA合成酶PRMT1表达或上调ADMA代谢酶DDAH2表达有关;　　(5)长期运动和限食降低内源性NOS抑制物ADMA含量可能与其增加骨骼肌收缩功能有关.