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第一章蛋白质芯片检测卵巢癌耐药细胞分泌型细胞因子表达差异
1资料与方法
1.1：研究对象：
(1)卵巢癌细胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8，均来源于美国标准菌库(ATCC)；
(2)卵巢癌细胞株A2780来源的1A9克隆及其相应的耐TAXOL细胞株PTX22(Emory大学肿瘤研究中心Dr.GiannakakouP赠送)；
1.2：实验方法：
(1)采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测卵巢癌细胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8的对常见化疗药物卡铂(CBPDA)，阿霉素(ADM)，泰素(TAXOL)和VP-16敏感性差异；
(2)使用细胞因子抗体蛋白质芯片检测试剂盒HV(人类细胞因子系列5)同步检测卵巢癌细胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8条件培养液79种分泌型细胞因子表达差异；
(3)使用细胞因子抗体蛋白质芯片检测试剂盒2000(人类细胞因子系列6+7+8)同步检测卵巢癌细胞株1A9及其相应的耐TAXOL细胞株PTX22的174种分泌型细胞因子表达差异。
1.3：统计学方法：蛋白质芯片采用RayBiotechINC蛋白质芯片分析工具软件密度值，药敏试验采用Sigmaplot软件作出浓度生存曲线及回归方程。数据用SPSS11.5FORWINDOWS软件处理，以P＜0.05为显著性差异标准。
2结果
1.药敏试验结果表明卵巢癌细胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3，OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8耐药性不同。
2.细胞因子抗体蛋白质芯片检测结果表明在卵巢癌细胞株IGROV1，SKOV3，OVCAR3OVCAR4，OVCAR5，OVCAR8中生长调节致癌基因(GRO)，生长调节致癌基因-α(GRO-α)，白介素-6(IL-6)，白介素-8(IL-8)，基质金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)6种因子在不同细胞株表达有显著差异：
3.卵巢癌细胞株SKOV3中GRO，IL-6，IL-8和TIMP-2均较4株与之相比相对敏感细胞(IGROV1，OVCAR3，OVCAR5，OVCAR8)增高，OVCAR4细胞中IL-6，IL-8较之IGROV1，OVCAR3，OVCAR5均升高。
4.细胞因子抗体蛋白质芯片检测结果表明在卵巢癌细胞株1A9及其相应的耐TAXOL细胞株PTX22中，神经生长因子受体(NGFR)，白细胞介素-8(IL-8)，IP-10，OncostatinM，正常T细胞表达的激活调节因子(RANTES)共5种因子在耐药细胞株中表达增高，而同时共有15种因子在在耐药细胞株中表达降低。其中炎症反应及趋化因子8种，细胞增殖的丝裂原及其抑制剂6种。
第二章白介素-6/8对乳腺癌细胞多药耐药作用机制的研究--乳腺癌耐药相关分泌型细胞因子筛查
1资料与方法
1.1：研究对象：
(1)人乳腺癌细胞MCF-7/S，及相应的耐阿霉素细胞株MCF-7/R(Emory大学妇产科研究室DrRuopanHuang提供)，MCF-7/R为采用逐步接触浓度递增的阿霉素诱导而成，经MTT法测定细胞的药敏性证实具有多药耐药性。(2)IL-6及IL-8SiRNA质粒阳性转染的MCF-7/R细胞株(Emory大学妇产科研究室DrRuopanHuang提供)，ELISA检测培养液IL-6或IL-8浓度证实蛋白表达抑制率，选择IL-6或IL-8蛋白抑制率大于80％的细胞各两株，(MCF-7/RpSiRNAIL-6，MCF-7/RpSiRNAIL-8)及空载体对照株各1株(MCF-7/RpRNAVector，MCF-7/SpRNAVector)。
1.2：实验方法：
(1)使用细胞因子抗体蛋白质芯片检测试剂盒1000(人类细胞因子系列6+7)同步检测MCF-7/S及MCF-7/R条件培养液120种分泌型细胞因子表达差异；
(2)采用酶联免疫分析(Enzyme-linkedimmunoadsordassay,ELISA)测定选择IL-6，IL-8，MCP-1MCF-7/S及MCF-7/R条件培养液浓度差异；
(3)采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测在MCF-7/S及MCF-7/R细胞培养液中加入不同浓度的IL-6抗体，IL-8抗体及二者的混合液后，其对阿霉素(ADM)，泰素(TAXOL)的药物敏感性变化；
(4)反转录聚合酶链反应(Reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)检测MCF-7/S及MCF-7/R细胞株I1-6，I1-8，IL-6受体α，IL-8受体CXCR1，IL-8受体CXCR2表达差异；
(5)westernblot检测MCF-7/S及MCF-7/R细胞株p糖蛋白(p-GP)，肺耐药蛋白(LRP)，多药耐药蛋白(MRP)及bcl-2蛋白表达差异；检测MCF-7/S细胞用0.1M的ADM处理，加药后0，24h，48h，72h，96h，120h，144细胞及MCF-7/RpSiRNAIL-6，MCF-7/RpSiRNAIL-8细胞LRP表达差异；检测MCF-7/RpSiRNAIL-6，MCF-7/RpSiRNAIL-8细胞bcl-2蛋白表达差异(6)免疫沉淀法westernblot检测bcl-2MCF-7/S及MCF-7/R细胞株色氨酸磷酸化差异，采用bcl-2抗体沉淀，然后分别以bcl-2及磷酸化色氨酸抗体为一抗进行westernblot检测。
2结果
1.细胞因子抗体蛋白质芯片检测结果表明在人乳腺癌细胞MCF-7/S，及相应的耐阿霉素细胞株MCF-7/R中的表达结果表明分泌型细胞因子中，有15种细胞因子在耐药株表达增高，5种细胞因子在耐药株表达降低，其中炎症反应及趋化因子7种，细胞增殖的丝裂原及其抑制剂6种。
2.ELISA测定结果表明在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/R的IL-6，IL-8及MCP-1分泌较敏感株MCF-7/S显著升高，敏感株MCF-7/S经阿霉素作用后IL-6，IL-8及MCP-1浓度随作用时间延长而增加。
3.药敏试验结果表明使用中性抗体阻断IL-6和/及IL-8均可使耐药细胞株MCF-7/R药物敏感性较使用IgG对照组增加，其中以双抗体组增加最明显。SiRNA抑制耐药细胞株MCF-7/R内源性IL-6或IL-8表达可使其耐药性较空载体对照组明显降低，接近敏感细胞株水平。
4.RT-PCR检测结果表明在乳腺癌细胞株MCF-7中，敏感株与耐药株均有IL-6和IL-8受体表达，其中在敏感细胞株中IL-6受体α，IL-8受体CXCR2，均较耐药株升高，而IL-8受体CXCR1在敏感细胞株中均较耐药株降低。
5.westernblot检测证实(1)在阿霉素诱导的耐药细胞株MCF7/R中，耐药相关蛋白表达状况为，多药耐药蛋白(MRP)表达与敏感株无显著差异，p糖蛋白(p-GP)及肺耐药蛋白(LRP)在耐药株表达升高。(2)在敏感株MCF-7/S经阿霉素作用后LRP表达随作用时间延长而增加。(3)IL-6siRNA和IL-8siRNA转染阳性细胞株LRP表达为阳性，与耐药细胞株MCF7/R类似。(4)MCF7/Rbcl-2表达较MCF7/S降低，且在IL-6siRNA和IL-8siRNA转染阳性细胞株中表达亦降低。(5)采用免疫沉淀法westernblot进一步检测证实MCF7/R的bcl-2色氨酸磷酸化增强。
6.氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入合成法证实经阿霉素处理后1-4天，MCF7/R细胞在各时间点均较MCF7/S增殖速率增加。
结论
1.通过对卵巢癌泰素耐药细胞株及乳腺癌多药耐药细胞株细胞因子筛选，发现多种细胞因子表达差异，在两组细胞均以炎症反应趋化因子和细胞增殖丝裂原及其抑制剂为主。推测卵巢癌乳腺癌细胞耐药的分泌型细胞因子调节可能主要通过这两条途径进行。
2.在常见分泌型细胞因子中，GRO，IL-6，IL-8和TIMP-2升高可能与卵巢癌一线化疗药ADM和CBPDA耐药性相关，IL-6，IL-8可能与卵巢癌二线化疗药TAXOL，VP16耐药性相关。
3.外源性IL-6和/或IL-8阻断均可增加耐药细胞株MCF-7/R的药物敏感性，若同时阻断两者作用呈现叠加效应，提示IL-6及IL-8均在乳腺癌耐药发生过程中具有重要作用。
4.尽管化疗药作用于MCF-7细胞引起时间依赖性IL-6及IL-8浓度增加的同时，也可引起肺耐药蛋白(LRP)时间依赖性表达增加，但是IL-6siRNA和IL-8siRNA阻断IL-6及IL-8生成的耐药性降低的细胞株其LRP表达却不降低，反而较敏感株升高，提示分泌型IL-6/IL-8影响耐药性可能并非通过调节肺耐药蛋白而起作用。
5.与预想不同，在耐药株中抗凋亡蛋白bcl-2并未过表达，反而较敏感株降低，且在IL-6siRNA和IL-8siRNA转染阳性细胞株中表达亦降低。但耐药株bcl-2色氨酸磷酸化明显增强，而磷酸化bcl-2具有促癌作用，可能是其凋亡调节及耐药发生的机制之一。