肝炎、肝硬化、原发性肝癌、先天性胆道闭锁、先天性酶缺乏性肝病和急性肝功能衰竭等难治性肝病、终末期肝病为全球医疗棘手问题，肝细胞移植(hepatocyte transplantation,HTx)为解决这些问题提供了新的途经，有可能与原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)一样成为上述疾病的可供选择的替代治疗方法。然而，由于肝细胞来源短缺、增殖困难等方面的限制，HTx的临床应用研究进展仍相当缓慢。　　 人类胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)建系成功无疑为解决细胞移植供体(种子)来源问题带来了希望。ESC具有无限的增殖潜能和发育的全能性，理论上，它可在特定条件下定向分化为成体所有种类的细胞，从而为细胞移植提供源源不断的种子细胞来源。目前已有不少成功在体外通过自发分化或者外源性因子的诱导将ESC诱导分化为肝细胞的报道，然而，由于对胚胎发育过程中基因激活与沉默的机制以及胚层、组织和细胞间的信息调控网络所知甚少，我们尚难以全面、有序地掌控ESC定向分化为肝细胞的进程，所获取的目的细胞在分化效率、均质性等方面离临床应用尚相距甚远。　　 ESC体外分化被认为是人体组织细胞发育的重演，其中涉及了基因有序地激活与沉默、增强与衰减，而众多转录调节机制精确地控制这一进程。microRNA(miRNA)是广泛存在于真核细胞内的转录后基因调节机制，在细胞生长与分化过程中扮演着极为重要的角色。目前已初步证明，miR-122在肝脏特异性高表达，并且在调控肝脏发育、肝细胞代谢等方面起着重要作用。　　 为探索miR-122在ESC分化为肝细胞过程中的调控作用与机制，我们初步进行了如下的实验研究：　　 1.细胞因子、丁酸钠联合诱导小鼠胚胎干细胞向肝细胞分化常规培养E14小鼠ES细胞后，继续悬滴培养3 d以形成拟胚体，然后转移拟胚体到6孔板中并添加FGF-410ng/ml、HGF20ng/ml、丁酸钠2.5mmol/L进行诱导分化。分化过程中用倒置相差显微镜观察细胞形态学的改变；免疫荧光染色观察肝细胞特异性标志白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)的表达；RT-PCR检测肝细胞特异性标志基因ALB、AFP、甲状腺素运载蛋白(TTR)的mRNA表达；流式细胞技术检测ALB阳性细胞比例；尿素合成功能检测则对其功能进行检验。结果显示：诱导分化过程中ES细胞逐渐出现肝细胞样改变；诱导分化第7d仅检测到AFP和TTR在mRNA水平的表达；第14 d检测到ALB在mRNA水平的表达；分化14 d时免疫荧光检测显示ALB、AFP、CK18均为阳性；流式细胞技术检测ALB阳性细胞比例约为68.23％；尿素合成功能检测见培养液内尿素氮的逐日升高，显示分化14d的肝细胞样细胞具有肝细胞功能。　　 2.诱导分化过程中miR-122表达水平的检测以诱导开始记为0d，分别取0d，3d，6d，9d，12d，15d细胞约105～106，采用quantitative Real-time PCR技术检测miR-122表达水平，各时间点检测重复3次，以均值绘制miR-122的时序表达曲线，结果显示在ESC体外诱导分化为肝细胞的各个时期miR-122表达都处于较低水平，但分化第9天细胞miR-122表达较前有明显上调。　　 3.miR-122真核表达载体的构建从小鼠基因组DNA扩增pre-miR122，克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP逆转录病毒载体上，测序鉴定，病毒包装后，转染NIH3T3细胞，并通过绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。结果显示成功构建表达miR-122的慢病毒载体，病毒的滴度为(1～5)×106 IU/mL。　　 以上结果明确了细胞因子、丁酸钠联合可以有效诱导小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞样细胞，并且分化细胞具有部分肝细胞功能；体外诱导分化过程中，ESC分化为肝细胞的各个时期miR-122表达都处于较低水平，但分化第9天细胞miR-122表达较前有明显上调，对miR-122表达载体转染时间点确定具有指导意义；成功构建出miR-122慢病毒表达载体pCDH-CMV-miR122-EF1-copGFP，为后续进一步深入研究增强表达miR-122对小鼠胚胎干细胞诱导分化为肝细胞的影响及其机制奠定了基础。