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第一部分 脊髓Tyr1472-NR2B在2型糖尿病神经病理性疼痛大鼠中的作用 目的：探讨脊髓中Tyr1472-NR2B是否参与大鼠2型糖尿病神经病理性疼痛(DNP)的形成。 方法：雄性SD大鼠，高糖高脂喂养8周复合腹腔单次小剂量注射链脲佐菌素(STZ)制备大鼠2型糖尿病模型。测机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）作为基础值，给予两周时间诱导糖尿病神经病理性疼痛，再次测MWT和TWL，降至基础值85%以下为2型糖尿病神经病理性疼痛大鼠，记为DNP组；若未降至基础值85%以下则为2型糖尿病无神经病理性疼痛大鼠，记为DA组。将2型DNP大鼠随机分成4组，每组24只：DNP组、DNP+NR2B抑制剂Ro25-6981组(Ro组)、DNP+NR2B-PSD95干扰肽Tat-NR2B9c(Ta组)和溶剂对照组(SC组)。在腹腔注射STZ14d后，Ro组、Ta组和SC组大鼠行蛛网膜下腔置管手术，3d后Ro、Ta和SC组分别给予Ro25-6981 10μL(20μg/μl)、Tat-NR2B9c 10μl(15ng/ul)和生理盐水10μL，每日1次，连续14d。另取15只SD大鼠普通饲料喂养作为对照组（C组）。在Ro组和SC组大鼠连续给药后的第3、7和14天时，测各组大鼠的MWT、TWL，在最后一次行为学检测结束后将大鼠处死，取L4-6脊髓腰膨大，提取蛋白，应用免疫印迹法检测Tyr1472-NR2B、PSD95表达。 结果： 1.一般情况：与C组相比，8周后D组大鼠体重明显增加，血糖升高，但并没有达到2型糖尿病诊断标准血糖≥16.7 mmol/L(C组：3.95±0.65mmol/l，D组：5.76±0.97mmol/l) ，而空腹12h后其胰岛素浓度明显升高且有意义(C组：16.29±2.90mmol/l，D组：40.07±7.64mmol/l，P＜0.05)， 胰岛素敏感性指数下降(C组：-4.13±0.17，D组：-5.41±0.25，P＜0.05)。 2.机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期(TWL)：注射STZ前，各组SD大鼠测量的MWT、TWL之间无统计学差异。与C组和DA组相比，在确定分组后的第3、7、14d DNP组MWT、TWL明显降低 (P＜ 0.05)；而DA组与C组之间无统计学差异。与DNP组相比，Ro、Ta组在给药后第3、7、14 d时MWT升高、TWL延长(P＜0.05)，而SC组与DNP组之间无统计学差异。 3.免疫印迹结果：与C组、DA组相比，DNP组在第3、7、14d时，脊髓背角Tyr1472-NR2B、PSD95表达明显增加(P＜0.05)，C组与DA组之间无统计学差异；与DNP组比较，在蛛网膜下腔给予NR2B抑制剂后，Ro组在第3、7和14天时脊髓背角Tyr1472-NR2B表达下调(P＜0.05)，同时Tyr1472-NR2B在Ta组也有相似的表现(P＜0.05)。PSD95表达量在Ta组与DNP组之间无差异。Tyr1472-NR2B与PSD95在DNP组与Sc组之间无统计学差异。 结论：2型糖尿病神经病理性疼痛大鼠中MWT、TWL的改变提示出现机械和热的异常性疼痛，DNP组脊髓中Tyr1472-NR2B、PSD95蛋白含量的改变提示Tyr1472-NR2B、PSD95参与大鼠2型DNP的发生和发展。在使用NR2B抑制剂或NR2B-PSD95干扰肽后之后痛阈的改变说明Tyr1472-NR2B与2型糖尿病神经病理性疼痛的形成密切相关。 第二部分 脊髓自噬在2型糖尿病神经病理性疼痛模型大鼠中的作用 目的：探讨脊髓自噬是否参与大鼠2型糖尿病神经病理性疼痛 (DNP)的形成。 方法：制备2型糖尿病神经病理性疼痛大鼠和2型糖尿病无神经病理性疼痛大鼠模型，取18只SD大鼠作为对照组(C组)。于确定分组后的第3、7和14天测量行为学机械缩足阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)，结束后各组随机挑选6只大鼠，取脊髓组织，采用Western blot法检测LC3、Beclin-1和P62各蛋白表达情况。另取6只7天DNP组用免疫荧光双染法检测大鼠脊髓背角P62与小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元的共染情况。 结果： 1.脊髓背角LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62免疫印迹结果：结果显示，与C组相比， DA组LC3-Ⅱ明显增加(P＜0.05)，表明自噬体合成增加，但DA组P62、Beclin-1水平与正常组相比无明显差异。与C组相比，DNP组LC3-Ⅱ、Beclin-1明显增加(P＜0.05)，并且P62表达下降(P＜0.05)，表明DNP组大鼠脊髓自噬功能激活。同时我们发现DNP组大鼠LC3-Ⅱ水平较DA组高且有统计学意义(P＜0.05)，可能表明DNP组大鼠自噬水平比DA组大鼠高。LC3-Ⅰ的表达量在三组间无明显改变 2.脊髓背角P62免疫荧光细胞定位：P62表达于脊髓背角，且主要与神经元标记物NeuN共存，少部分与小胶质细胞标记物OX42共存，几乎不与星形细胞标志物GFAP共定位。 结论：脊髓中LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62蛋白含量的改变提示脊髓自噬功能激活；脊髓背角中神经元自噬激活在大鼠2型DNP的发生和发展起着关键的作用。