氧化苦参碱体外抗犬博卡病毒(MVC)感染的作用研究

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目的:犬博卡病毒(Minute virus of canines,MVC)是一种体积小,无包膜、能够自主复制的单链DNA(ssDNA)病毒,是犬类多种疾病发生的病原体。氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)作为苦参的主要有效成分之一,具有抗炎抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常和抗纤维化等功效。尤其在抗病毒方面,对于多种病毒都具有抵抗作用。本研究中,我们主要通过观察氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)对犬博卡病毒(MVC)感染引起的沃尔特里德犬(Walter Reed canine cell/3873D,WRD)细胞凋亡、细胞周期与活力的变化以及对病毒基因的复制和表达、病毒颗粒形成的影响,以此来探究OMT体外抗犬博卡病毒的作用。方法:首先,以0.5mM至20mM(mmol/L)系列浓度的OMT孵育WRD细胞72h,采用CCK-8法确定氧化苦参碱使用的安全剂量,并以MVC感染WRD细胞建立感染模型,在安全剂量的干预下检测氧化苦参碱对感染细胞活力的影响;其次,以4mM(安全剂量浓度)的OMT对感染的细胞进行干预,一方面采用Southern blot检测氧化苦参碱对病毒基因组DNA复制的影响,同时分别采用Western blot和qRT-PCR技术对病毒基因NS1、NP1和VP2的蛋白以及mRNA表达水平进行检测,比较OMT干预组与病毒组,观察氧化苦参碱对病毒基因表达的影响,另一方面采用免疫荧光法观察病毒颗粒的形成;与此同时,流式细胞术和Western blot检测细胞周期、细胞凋亡的变化,以及凋亡相关基因Caspase-3的激活和Bcl-2的表达。结果:1.病毒感染复数一定(MOI:10)时感染细胞,不同OMT浓度(0.5mM至20mM)进行干预,与感染组相比,干预组中感染细胞的活力值明显升高(**P<0.01);病毒感染复数不同(MOI:2.5、5、10、20、40、80),以一定浓度的OMT(安全剂量4mM)对感染细胞进行干预,与感染组相比,随着病毒感染复数不断增大,细胞活力降低(*P<0.05)。2.与感染组相比,加入OMT进行干预后,病毒基因组DNA的复制和病毒基因NS1、VP2和NP1表达水平明显降低(*P<0.05),病毒颗粒的形成明显减少。3.相较于感染组,在感染早期,OMT干预组中S期阻滞明显缩短,在感染后期,细胞凋亡明显减少(**P<0.01)。4.与感染组相比,加入OMT进行干预后,凋亡因子Caspase-3的激活产物的表达降低(*P<0.05),抗凋亡因子Bcl-2的表达增强(**P<0.01)。结论:1.OMT能够显著提高MVC感染靶细胞的细胞活力,使细胞凋亡减少并保护细胞,发挥抗MVC活性的作用。2.OMT能够抑制病毒基因组DNA的复制、病毒基因的表达、病毒颗粒的形成以及缩短感染早期S期的阻滞。3.OMT减少感染细胞的凋亡,可能与抑制凋亡因子Caspase-3的激活,增强抗凋亡因子Bcl-2的表达有关。
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